英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
做Western Blot发光实验经常有“背景太高”问题的出现，要弄清“背景太高”的原因，先要知道“背景”是什么，“背景”也是发光，影响发光的因素就会影响背景。 影响发光的因素主要有：1.含HRP的抗体；2.发光试剂；3.和发光试剂反应的杂质，如含杂质的膜。这里面，在很短时间内曝光造成的背景多是由于含HRP的抗体的因素造成的，抗体浓度过高，洗涤不充分，封闭不 …
阅读更多 »Western Blot化学发光(ECL)背景太高的原因？
动物实验系列篇章之一——实验动物的抓取和固定
在进行实验时，为了不损伤动物的健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，首先要限制动物的活动，使动物处于安静状态，工作人员必须掌握合理的抓取固定方法。抓取动物前，必须对各种动物的一般习性有所了解。操作时要小心仔细、大胆敏捷、熟练准确、不能粗暴，不能恐吓动物，同时，要爱惜动物，使动物少受痛苦。 一、小鼠 小鼠性情较温顺，一般不会咬人，比较容易抓取固定。通常用右手 …
阅读更多 »RNAi、miRNA及siRNA的区别和联系
RNA干扰 （RNAi）：近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰（RNAi）。 MicroRNA（miRNA,微RNA）： …
阅读更多 »动物实验系列篇章之七—— 实验动物的处死
当实验中途停止或结束时，实验者应站在实验动物的立场上以人道的原则去处置动物，原则上不给实验动物任何恐怖和痛苦，也就是要施行安乐死。安乐死是指实验动物在没有痛苦感觉的情况下死去。实验动物安乐死方法的选择取决于动物的种类与研究的课题。 一、蛙 类 常用金属探针插入枕骨大孔,破坏脑脊髓的方法处死。将蛙用湿布包住，露出头部,左手执蛙，并用食指按压其头部前端，拇指按压 …
阅读更多 »动物实验系列篇章之三——实验动物的麻醉方法
麻醉(anesthesia)的基本任务是消除实验过程中所至的疼痛和不适感觉，保障实验动物的安全，使动物在实验中服从操作，确保实验顺利进行。 一、常用的麻醉药 (一)常用局部麻醉剂：普鲁卡因，此药毒性小，见效快，常用于局部浸润麻醉，用时配成0.5％～1％；利多卡因，此药见效快，组织穿透性好，常用1％～2％溶液作为大动物神经干阻滞麻醉，也可用0.25％～0.5％ …
阅读更多 »siRNA转染后什么时候做qRT-PCR检测最好？
1.siRNA转染后什么时候做qRT-PCR检测最好？ siRNA的沉默效果是有时效性的，在最佳的时间点观察，会得到更加明显的沉默效果，这个时间点的确定不能以同一株细胞转染DNA的经验确定，因为一个是消耗mRNA，一个是产生mRNA。对转染siRNA，在核酸水平，转染后8-48小时，即可观察到mRNA水平的逐步下降，一般来说，转染后48小时进行qRT-PCR …
阅读更多 »一个抑制脑中风的miRNA
MicroRNAs（miRNAs）是一类非编码小RNA，miRNAs能结合到靶基因mRNA的3’非翻译区诱导转录退化和/或抑制翻译。miRNA在多种病理生理过程中发挥着重要的作用。 Let-7c是最丰富且高度保守的miRNA。以往的研究表明，let-7c通过调节细胞增殖和细胞凋亡抑制癌细胞存活率。最近研究表明Let-7c是巨噬细胞极化的重要调节器。 Let- …
阅读更多 »Western blot实验最常见的10个问题及解决方案
1、Western Blot原理 Westernblot的原理是蛋白质在电力场的作用下，由大到小的进行排列，利用电泳进行分离和富集。拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体（一抗）特异性识别并与之结合。在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。 Westernblot显色的方法主要有以下几种：（1）放射自显影，（2）底物化学发光E …
阅读更多 »病毒转染原理及步骤
病毒转染原理及步骤 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 病毒转染包括以下步骤：1构建载体 2包装提纯病毒 3感染靶细胞。以慢病毒为例。 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起 …
阅读更多 »细胞转染为什么不能加血清？
看过很多细胞转染的高手，在做真核细胞转染时，都是在把核酸和转染试剂的混合液加入细胞表面以前，将融合的细胞的含血清的培养液弃去，用无血清培养基清晰后再加入混合物，4-6h后再换含血清的培养基。这是为什么呢？为什么这些转染试剂要求不含血清呢？ 传统的转染试剂有一定的细胞毒性，在转染过程由于提高细胞的通透性因而不能在培养基中添加抗生素。如，阳离子脂质体。带正电的脂 …
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