Western Blot是检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化的首选方法,也是实验室常见的实验方法。 完整的Western实验过程比较长,做一次Western也不容易。有结果当然是好的,没有结果也是常有的事,出现各种烦心结果也是时有发生。其中最常见的一种就数显色后背景高了。背景高,目的蛋白颜色对比不明显,要么看不清,图片展示不理想,更 …
阅读更多 »蛋白质凝胶电泳注意事项
大多数蛋白质凝胶电泳是还原性条件下的十二烧基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE) 。 *样品准备 还原试剂2-巯基乙醇或者二硫苏糖醇加在变性胶的样品缓冲液中,还原蛋白质中的二硫键,确保蛋白质维持在测定分子量所需的无规则卷曲状态。 样品缓冲液分成小管,贮于-20℃ 。甘油浓度很高,足以防止样品冻结,所以不必担心冻融所造成的损伤。当管中没有还原试剂的味 …
阅读更多 »western-blot实验中ECL发光检测操作步骤
ECL Western特异发光检测试剂盒用于辣根过氧化物酶(HRP)标记的蛋白或核酸检测。下面以engreen的超敏型ECL发光液Enlight-Plus为例,说一下检测实验步骤。 1. 常规电泳、转膜、HRP 标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。以下操作在室温进行。 注意:Enlight-Plus 推荐的抗体稀释度为: 储存液浓度为1mg/ml 的一抗推荐稀释度 …
阅读更多 »SDS-PAGE的主要应用有哪些?
SDS-PAGE原理 蛋白质是两性电解质,在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液的pH小于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 不同蛋白质具有不同的等电点,在进 …
阅读更多 »western-blot实验时,胶片上条带很弱怎么办?
条带弱的原因可能有以下几个方面: ①. 因为蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成。可适当加大蛋白上样量,也可通过提高抗体稀释度或采用灵敏度更高的发光底物来调整,如英格恩的Enlight-plus。 ②. 蛋白没有充分转移到膜上。转膜后可通过预染Marker判断转膜效率,也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶,判断转膜效率。 ③. 抗体效价 …
阅读更多 »导致western Blot发光(ECL)“背景高”的原因有哪些?
Western Blot发光经常有“背景太高”问题,导致“背景高”的原因有很多,主要有以下几个方面: 1. 抗体浓度过高,洗涤不充分,可以造成抗体在膜上的非特异结合,导致高背景。可通过降低抗体稀释度,增加洗膜次数和Buffer用量,或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20加以改善。 2. 封闭不充分,会造成抗体在膜上的非特异结合,导 …
阅读更多 »ChIP超详细实验步骤
ChIP的一般流程: 甲醛处理细胞—收集细胞,超声破碎—加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合—加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀—对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合—洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物—解交联,纯化富集的DNA-片断 …
阅读更多 »常用的蛋白水解酶抑制剂
当细胞被裂解,内容物释放时,蛋白水解酶和其他一些降解的酶也一同被释放,这时候需要在裂解的缓冲液中加入蛋白水解酶。PS: 细胞自己的蛋白水解酶也会降解细胞内的蛋白质。 抑制剂 靶向的蛋白酶 有效浓度 储存浓度 其他 抑蛋白酶肽 丝氨酸蛋白水解酶 0.1-2ug/ml 10mg/ml溶解在PBS中 避免反复冻融 EDTA 金属蛋白水解酶 0.5-2mmol/L …
阅读更多 »分子克隆中常用的其他酶
一、DNA 聚合酶 分子克隆中的许多步骤都涉及在DNA 聚合酶催化下的DNA 体外合成反应。这些酶作用时大多需要模板,合成产物的序列则与模板互补。大多数聚合酶优先作用于DNA 模板,但也可拷贝RNA ,尽管这时效率较低。最常用的依赖于DNA 的DNA 聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶 I (全酶)、大肠杆菌DNA 聚合酶I 大片段(Klenow 片段)、T4 …
阅读更多 »如何将胶内物质转移到膜上?
凝胶是厚而易碎的基质,这使得操作与温浴都很困难。如果要对胶内的内容物进行杂交,必须将内容物从凝胶引导到硝酸纤维素膜或者尼龙膜上。这一过程称为转移。 转移之后,滤膜与一个探针温浴,观察探针是否能与滤膜上的分子杂交。探针由放射性元素或者其他指示剂标记,所以可以被检测。滤膜与探针的杂交称为印迹。 第一次使用印迹技术是由Southern 描述的, 因此, 这种印迹被 …
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