英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
测序正确是一个重要的验证步骤，但它不能完全说明shRNA构建没有问题。下面我会具体说明为什么。 测序正确说明了什么？ shRNA序列（包括发夹结构、目标序列）与设计一致： 如果你对构建后的质粒进行了Sanger测序，序列结果和你设计的shRNA完全一致，这说明你的克隆步骤（连接、转化等）是成功的。这意味着你至少在DNA水平上构建了正确的序列结构。 但这并不代 …
阅读更多 »电穿孔和电融合技术原理及流程
[实验原理] 当细胞置于非常高的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分子扩散进细胞内，这一现象称为电穿孔。运用这一技术，许多物质，包括DNA、RNA、蛋白质、药物、抗体和荧光探针都能载入细胞。作为一种基因转导方法，电穿孔已被广泛用于各种细胞类型，包括细菌、酵母、植物和动物细胞；而且，它还能作为注射方法（称为电注射），把各种外源物质引入活细胞。与其他常用 …
阅读更多 »细胞电转后，72小时铺板加药筛选是否可行
一般情况下，在细胞电转后进行72小时的培养再加药筛选是可以的。具体取决于你的实验设计和细胞类型。以下几点你可以考虑： 细胞恢复时间：不同的细胞系在电转后需要不同的恢复时间，一般48-72小时是常见的恢复窗口。确保细胞已经充分恢复正常的代谢和生长活动。 药物筛选时间：72小时后加药筛选通常是为了确保细胞稳定表达你引入的基因或者达到特定的实验状态。如果是抗生素筛 …
阅读更多 »细胞转染的方法有哪些？
1. 脂质体法。中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。脂质体法始于1987年，此法的出现使得转染效率、转染的稳定性和可重复性大大提高。阳离子脂质 …
阅读更多 »请问那乳胶法能测出失活病毒么
乳胶法（Latex agglutination test）是一种常用于检测抗原或抗体的免疫学方法，通过抗原抗体反应引发乳胶微粒的凝集。乳胶试剂通常含有涂有已知抗原或抗体的乳胶微粒，这些微粒能够与相应的抗原或抗体结合，形成可见的凝集反应。 乳胶法检测失活病毒的可行性 乳胶法 本质上是基于抗原-抗体反应来进行检测的。如果病毒被“失活”（即病毒的活性丧失），但其结 …
阅读更多 »提高RNA转染效率的几点建议
1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …
阅读更多 »慢病毒感染后多长时间换液和多长时间检测?
在慢病毒感染的实验中，通常的做法是，在感染后24小时更换培养液，目的是去除未吸附的病毒和残留的病毒介质，避免对细胞的毒性影响。更换培养液后，细胞会继续培养，通常会保持培养在常规的全培液中。 对于延长观察时间的问题，感染后72小时一般是观察慢病毒感染效果的一个标准时间点，因为大多数慢病毒的转导效率在72小时内达到峰值。尽管感染后24小时更换培养液，但并不意味着 …
阅读更多 »贴壁细胞的分瓶操作步骤
1.从细胞单层吸出培养基。2. 缓慢加入37’C 温浴的PBS 或不含血清的培养基，让培养基沿容器壁流下，注意不要滴在细胞上，以免冲掉附着不牢的细胞。3. 再吸出PBS 或培养基。4. 加入含0.25 ％胰蛋白酶的PBS, 加入蜇以刚刚没过细胞为宜。5. 立即吸去胰蛋白酶，停留在细胞上的时间为10 ~ 30s(可以用不含血清的旧培养基多洗细胞几次 …
阅读更多 »培养基中pH 的调节
大多数细胞系增殖的最适pH 为7. 4, 当培养液逐渐变酸或变碱时，细胞的活力和增殖率将呈下降趋势。培养液必须缓冲细胞代谢葡萄糖和谷氨酰胺所产生的CO2 及乳酸。人们曾一度用碳酸氢盐、HCO3–与空气中CO2 共同构成一个缓冲体系，碳酸氢盐的低pka(pka=6. 1) 在pH7. 4 左右产生微弱的缓冲效能。无毒缓冲剂，如PIPES(pka=6 …
阅读更多 »细胞RNA转染实验的一些建议
1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …
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