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RNA的提取方法及原理

RNA提取原理

RNA提取时,加氯仿后分三层:水相(含rna,可能还有少量DNA),中间白色薄层(应该是蛋白和DNA),下层有机相(氯仿和蛋白等)

氯仿是分子量比较大的有机溶剂,在提取RNA时,氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合,从而使得蛋白和DNA脱离,DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离,否则DNA会释放到水相。不管有酚也好,没有酚也好,氯仿本身也对蛋白有变性作用,剧烈的震荡,很容易使得DNA的亲水基团,与水相接触。所以不要剧烈震荡。

RNA

异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护,等同于沉淀,但是这是个反应时发生在水相中,与前面的氯仿不矛盾。

氯仿的作用有多个方面,一是作为有机溶剂变性蛋白,使其沉淀并通过离心除去,同时也通过变性作用抑制RNase活性;二是RNA提取试剂中通常含有苯酚(Trizol主要成分就是苯酚,很多自己配试剂提的方法也用苯酚,抽提蛋白时也会用到苯酚),苯酚微溶于水,抽提烷之后水相里有痕量的酚,如果不除去会损伤核酸,需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉;三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质(比如油脂、脂溶性色素等),起到一定除杂作用。

因为细胞中存在DNA酶,在提取之前细胞破碎的时候没有加DNA酶抑制剂,DNA已经被分解了。上层水相,PH 5.1左右,当溶液pH在酸性的时候,DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面,只有RNA分子留在水相。而当pH接近中性时,DNA就会溶解在水相,(导致PH中性的大概原因是trizol与样品比例不对,应该尽量保证提取量的前提下使trizol过量)

TRIzol Reagent 提取total RNA步骤:

1.    查下表根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中,注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%。

组织量 TRIzol Reagent 氯仿 异丙醇 75%乙醇
50~100mg 1ml 0.2ml 1ml 1ml

2.将组织样品放入TRIzol Reagent中,高速下匀浆15-30秒/次,直至看不见组织和细胞碎片。

3.室温温育10分钟。

4. 据表2加入适量体积的氯仿,剧烈震荡15秒钟,然后室温下温育3分钟。

5. 4ºC,12000g离心15分钟,形成淡红色的苯酚/氯仿有机相,中间相和上层水相,水相约占TRIzol体积的60%。

6. 转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中。根据表2加入适量异丙醇,-20ºC沉淀1小时以上。

7.  4ºC,12000g离心10分钟。

8. 去上清,据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。

9. 4ºC,7500g离心5分钟。

10.去上清,空气中干燥或真空抽干RNA沉淀,但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。

11.取少量RNA用于测定其OD值和电泳,其余置-80ºC冰箱中保存。

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