英格恩技术博客 专注转染等实验

成功转染siRNA的主要关键点有什么?

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1.设计合成有效的siRNA

RNAi的核心需要siRNA对相应mRNA进行有效的结合和作用。siRNA的设计合成首先很重要,最优的设计可以用最小的工作浓度取得满意的沉默效果,减少副反应的发生。siRNA的设计可以通过检索,优先选用经过验证的siRNA或设计多对siRNA。需要强调的是,需要同时设置阴性对照以排除非特异沉默现象和阳性对照以确认整个实验体系的有效性。

2.合成的siRNA注意纯度和工作浓度

siRNA的合成需要注意的是一定要选用高纯度的siRNA,siRNA的纯度直接关系到转染效率和沉默效率。siRNA的工作浓度和siRNA的设计、细胞种类、目标基因有关。建议一定进行相关的预实验优化各条件。

  1. 选择合适的细胞铺板密度

成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调,但未成功转染的细胞却不受影响,这时转染效率和总的细胞数量就很重要,一般细胞数量较少时转染效率高,一些试剂由于本身毒性的影响,太低的细胞数量时毒性明显,所以会要求较高的细胞密度(汇合度),顺便说一句,看一个转染试剂的毒性,看它要求转染时的细胞密度就知道了。siRNA的转染和DNA的转染不一样,DNA的转染是过量表达,死亡一些细胞对过量表达的蛋白本身来说影响不大,但siRNA的转染,死亡的细胞所有的基因表达(包括特定目标基因)都下降,将与siRNA造成的特定目标基因的表达下降现象是一致的,将大大影响实验结果。选用低细胞毒性的转染试剂其实很重要。如果转染时铺板密度较高,细胞一方面转染效果不理想,直接影响沉默效果和数据可靠性,另一方面,48小时甚至更长时间后,沉默检测最佳点时,过于密集的细胞将影响细胞状态,从而影响实验结果。

4.选择合适的siRNA转染试剂

选择合适的siRNA转染试剂是的RNAi实验成功另一个关键。由于细胞毒性对siRNA实验的影响非常大,可以直接影响实验结论和结果,所以一定选择低毒性的转染试剂,看一个转染试剂毒性是否低,有一个简单的方法,看转染的过程和要求,比如要求的细胞密度越大,说明毒性越大,比如转染复合物容许和细胞孵育的时间越短,说明毒性越大。除了低毒性,还最好操作简便,越简单越好,比如有的转染试剂要求转染前换无血清培养基或低血清培养基,转染后又要有血清培养基,实际上,由于培养条件的频繁变化,可能会对细胞表达模式产生影响,对后续的mRNA和蛋白分析也同样产生影响,最终影响实验的可靠性。

EntransterTM-R siRNA专用转染试剂,采用先进的纳米聚合物成分,细胞毒性非常低,转染时细胞密度可以低至20%,同时可以有血清有抗生素转染,转染后无需换液,转染效率高,细胞毒性小,节约时间、精力和试剂,目前被许多著名实验室选用,是一款优秀的siRNA转染试剂

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