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磷酸钙-DNA共沉淀法的原理和步骤

前些时间有微友在平台上咨询细胞转染的事项,并对一篇博客文章《为什么磷酸钙转染并不稳定?为什么磷酸钙转染并不经济?》比较感兴趣。在这里,对这位微友的疑惑进行更加全方位的了解,在此将磷酸钙转染的原理和步骤和大家分享,以供交流讨论。

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核酸以磷酸钙-DNA 共沉淀物的形式出现时,可使 DNA 附在细胞表面,这有利于细胞吞入摄取核酸,或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内,进入细胞的DNA,仅有1%~5%可以进入细胞核中,其中仅有不到1%的DNA可以与细胞 DNA 整合,在细胞中进行稳定表达,基因转导的频率大约为10-4,这项技术可以用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。该方法往往被用于贴壁细胞的转染。

  1. 试剂的配制

(1)2×HBS 1.63 g NaCl ; 1.19g Hepes; 0.023 g Na2 PO4 ·2H2 O; 加水至100 ml pH 7.1 过滤,4℃保存

(2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌

(3)TE:0.1mmol/L EDTA,1mmol/L Tris-HCL PH 8.0

(4)G418(新霉素G418)液:1g G418溶于1mmol/L Hepes液中,加H2 O至10mL过滤除菌4℃保存。

(5)G418选择培养基:用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418,G418浓度为200~ 800mg/L

注意:对受体细胞先做预试验,选用浓度为在10~14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。

  1. 操作步骤

(1)供体DNA制备:方法按前介绍的DNA提取法提取,溶于TE中,40mg/L。

(2)受体细胞的培养:研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等,该细胞有一定自发转化倾向,一般在转染前一天接种细胞,接种密度为2×104 /cm2 ,用含10%胎牛血清的DMEM液,37℃、5%CO2 培养,待细胞占50~70%瓶底面积时,用于转染试验。

(3)DNA-磷酸钙沉淀物的制备

①将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液,同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo为1~2mg/L的使用量)。

②取500μl上述DNA溶液加入硅化试管中,缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2 混匀30秒。

③然后立即混旋,室温下静置30分钟,待溶液轻度混浊后,吹打后即用于转染受体细胞。

(4)转染受体细胞

①将处于对数生长期已占瓶底50~70% 的受体细胞,在转染前4小时更换一次新鲜培养基,每瓶5ml(25ml培养瓶)。

②吸取0.5mLDNA-磷酸钙沉淀,加入含5mL培养液的细胞瓶中摇匀。

③置37℃ 5% CO2 培养24h或更长,使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒。

④更换新鲜培养基,继续培养24小时,诱导转染基因的表达。

⑤更换浓度 800mg/L的G418选择培养液进行筛选。同时设有未能转染的对照细胞。

⑥培养大约3~5天,对照细胞大部分死亡,这时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择培养基,每3~4天更换一次选择培养基。

⑦ 2 周后,对照细胞死亡,在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现,待其增大后再进行化和扩大培养,可建立转化细胞株,并做进一步鉴定。

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