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WB发光检测中常见的问题及解决方法

免疫印迹试验(Western blot)是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。其中较为简单也为大家所普遍接受的Western blot显色方法为底物化学发光法ECL,文章根据发光检测中常见的几种问题现象与各位生物人一起探讨。疫印迹试验(Western blot)是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。其中较为简单也为大家所普遍接受的Western blot显色方法为底物化学发光法ECL,文章根据发光检测中常见的几种问题现象与各位生物人一起探讨。

众所周知,Western blot的原理是蛋白质在电力场的作用下,由大到小的进行排列,利用电泳进行分离和富集。拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体(一抗)特异性识别并与之结合。在此基础上,酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗,通过与底物反应显色来观察目的蛋白。

Western blot显色的方法主要有以下几种:一、放射自显影,二、 底物化学发光ECL,三、底物荧光ECF,四、底物DAB呈色。现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大部分Western blot显色底物是化学发光底物,发表文章通常也是用底物化学发光ECL。

ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下,氧化化学发光物质鲁米诺(lumino,氨基苯二酰一肼)并发光,在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍,通过将印记放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。ECL法操作简便,应用现成的试剂盒,按照说明,将两种显色底物等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀,用玻璃胶片把膜包起来,马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面,显影、定影(或用荧光检测仪检测)。

ECL法具有灵敏度高,线性范围广等特点。

Western blot发光检测受多种因素影响,主要包括:抗原含量,抗体敏感度,底物敏感度,显影和定影效率,等。现根据检测中几种常见的现象问题进行分析:

  • 目的蛋白信号弱或无。在Western blot发光检测中常见的问题之一就是目的蛋白信号弱或无。首先考虑是否转膜不充分/过转,如果是,则要优化转膜条件;其次,在转膜合适的前提下考虑是否抗体-抗原敏感性过低,也可能是底物HRP或底物活性降低,可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。曝光时间短也会使蛋白信号降低,因此,要延长胶片的曝光时间。
  • 背景较高。背景深是在Western blot发光检测中最常见的问题,造成背景深的原因很多。第一,封闭的问题,封闭条件一般为5%牛奶或BAS室温封闭2-4h,但最好4度过夜;实际上牛奶对于多数抗体来说效果不错,但二抗与牛奶可能有交叉反应,因此洗涤很重要。另外BSA蛋白单一,可降低因牛奶其他成分引起的背景。第二,TBST洗脱不彻底也会导致背景深,适当增加洗脱时间、次数、用量可以减轻背景颜色。第三,条带背景深也与曝光时间有关,曝光时间超过半小时出现背景是很正常的,所以可以的话建议曝光1-10min。英格恩公司生产的Westernblot 发光试剂EnlightTM含独特的发光增强剂和精准的发光底物,比普通发光试剂灵敏度更高、更稳定,而且发光时间长,背景更低。第四,抗原-抗体浓度/HRP过高时,直接或间接结合在膜上,洗脱不掉等原因,考虑降低抗体浓度或蛋白上样量。enlight-1
  • 非特异性条带。非特异性条带与抗体交叉反应有关。单抗比多抗特异性好,纯度高,另外适当稀释一抗/二抗浓度,也是有必要的。如果样本在处理过程中发生降解,则样本处理时加入蛋白抑制剂在冰上操作。
  • 显影后膜上条带处变为黄色或为白色。可能是HRP过高导致的敏感性或背景太高,应降低抗体浓度。
  • 条带内无显影的白点与转膜和显影的操作有关。转膜前尽量将膜平衡,并注意胶和膜之间避免气泡,显影时膜与X光片间也应避免气泡。
  • 散在小圆斑是牛奶封闭液中的杂质颗粒导致的,解决此类问题可提前配置好封闭液于4度保存,使用时勿混匀,仅用上层。

Western blot发光检测中常见问题及解决办法

现象 原因 解决办法
信号弱或无 HRP过高引起底物迅速耗竭 稀释一抗/二抗
抗体-抗原系统敏感性过低 提高抗体浓度/蛋白上样量
转膜不充分/过转 优化转膜条件
HRP或底物活性降低 测试活性或选用敏感底物
高背景 HRP过高(背景较高) 稀释一抗/二抗
封闭时间不足 延长封闭时间4度过夜最好
抗体与封闭液有交叉 更换封闭液(如3%BSA的TBST)
TBST洗脱不足 增加洗脱时间、次数、用量
曝光时间过长 降低曝光时间
抗原-抗体浓度过高 降低抗体浓度或蛋白上样量
条带内无显影的白点 转膜不良(如有气泡在胶-膜之间) 精细操作
膜平衡不均/油脂污染 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜
膜与X光片间有气泡 显影前去除气泡
非特异性条带 抗体交叉反应 稀释一抗/二抗
散在小圆斑 封闭液有杂质颗粒 静置牛奶使大颗粒沉淀,仅用上层
反影(白色条带,黑色背景) HRP过高(背景较高) 稀释一抗/二抗
显影后膜上条带处变为黄色 HRP过高(敏感性太高) 稀释一抗/二抗

底物化学发光ECL是Western blot最常用的显色方法之一,因此,熟悉并掌握其中最常出现的问题及解决办法是做好Western blot发光检测的基础。

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