体外转录法制备dsRNA

该方案是简单而且得到广泛应用的、利用PCR 模板制备双链RNA 的体外转录反应。该方法制备的dsRNA 可以用于在某些细胞或者组织中诱发RNA 干扰。

试剂

琼脂糖凝胶( 1 %)
复性缓冲液( 10 X)
ATP 、CTP 、GTP 、UTP （ 每种100mmol/L )
二硫苏糖醇( DTT ) ( 1mol/L)
DNA 分子质量标准
dNTP 混合液，每种10mmol/L
乙醇( 100％和70%)
Ficoll-Orange G 上样缓冲液( 6 X)
非变性凝胶上样缓冲液( 10 X)
无核酸酶水
寡核昔酸引物
PCR 缓冲液( 10 X) <R>
酚： 氯仿( 1 : 1, VIV)
无RNA 酶的胰腺DNA 酶Ⅰ ( 2U/μL)
乙酸钠( 3mol/L , pH 5.2 )
SYBR Gold ( 10000 X) 或者溴化乙锭（10mg/mL)
T7RNA 聚合酶( 20U/ μL)
T7 转录缓冲液（10 X)
TAE 缓冲液( 50 X , 1 X)
Taq DNA 聚合酶( 2.5U/μL)
TBE 缓冲液( 5 X , 0.5 X)
PCR 用DNA 模板

设备

琼脂糖凝胶电泳仪
离心机
微量离心管(1.5m.L)
PCR 管(0.5mL, 薄壁）
Primer3 软件
分光光度计
热循环仪
涡旋振荡器

方法

制备体外转录用DNA 模板

1 在有关的数据库或者根据序列数据，分析目的基因的mRNA 、cDNA 或者基因组序列。
2 选择长度为500~800bp 的靶区域作为dsRNA 模板。
3 利用BLASTn 有义链和反义链进行同源性分析。如果某条链与非目的靶基因同源，则重复步骤2 。
4. 用Primer3 软件设计长度为20 ~ 24 个核昔酸的正向和反向引物，使其T_m值约为60°C（http://primer3.sourceforge.net/) 。
5. 将T7 启动子序列( 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′) 加到两条引物的5’端。需要准备带有或者不带有T7 启动子序列的正向和反向引物（两对引物） 。
6 分别进行两套PCR 反应，生成RNA 有义链和反义链所使用的DNA 模板。每生成一个DNA 模板，需要将下列试剂在 1.5mL 试管中配制成一个500μL 的PCR 体系：

模板DNA	—a
无核酸酶水	加至395μL
PCR 缓冲液( 10 X)	50μL
dNTP 混合液（每种10mmol)	10μL
正向引物（ 10μmol )	20μL
反向引物( 10μmol )	20μL
Taq DNA 聚合酶	5μL ( 12.5U )
总反应体积	500μL

a 用作PCR 的模板，使用0.05 ~100ng 克隆的质粒或噬菌体DNA , 0. 5~ 5μg 基因组DNA, 或者10~20μL 反转录反应生成的cDNA 。

7 轻微混合，涡璇离心1 ~ 2s 将试剂甩至试管底部，然后将其分装到为0.5mL 薄壁PCR管中，每份100μL 。
8 将试管放入热循环仪中，按下列程序进行25 个扩增循环：
i. 94 ℃    2min
ii. 94℃    45s
iii. 50℃   45s
iv. 72℃   60s
v 再次重复ii~iv, 24 个循环。
vi. 72 °C  5min
vii. 4 °C   保存
viii. 结束

9 同时，用TAE 缓冲液制备一块1 ％的琼脂糖凝胶 。
10. PCR 反应结束后，将5μLPCR 产物与1μL 6X Ficoll Orange G 上样缓冲液混合后上样通过电泳分析PCR 产物。Orange G 染料位于电泳的前沿而不会在电泳时遮盖任何条带。
11. 将步骤10 剩余的DNA 扩增产物转移至一个新的1.5mL 微量离心管中，加入1/10体积的乙酸钠（3mo l/L, pH 5.2) 和2.5 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀，在－20°C 或者更低的温度下放置30min 以上，使PCR 产物沉淀。4°C 最大转速离心30min, 弃去上清。
12. 用1mL 70％乙醇洗沉淀以去除残留的盐类。4 °C 最大转速离心5min, 最大可能地弃去上清(70％乙醇），然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。
13. 将DNA 沉淀溶解于50μL 水。

制备dsRNA

14. 将T7RNA 聚合酶置于冰上放置，其他试剂室温放置。室温下，按下列配方在1.5mL微量离心管中配制一个100μL 的体外转录体系：

无核酸酶水	56.5μL
T7 转录缓冲液( 10 X)	10μL
PCR 模板DNA	5μL
ATP ( 100mmol/L）	5μL
CTP (100mmol/L )	5μL
UTP ( 100mmol/L）	5μL
GTP （100mmol/L）	8μL
OTT ( 1mol/L)	0.5μL
T7RNA 聚合酶	5μL (100U)

如果实验需要更多的RNA, 等比例扩大反应体系。

15 轻轻涡旋1 ~ 2s 使试剂离心至试管底部。
16 37°C 孵育2h 。
17 加入5μL （ 10U) 无RNA 酶的胰腺DNA 酶I (RNase-free pancreatic DNase I) 。
18 轻轻涡旋1 ~ 2s 使试剂甩至试管底部。
19 37°C 孵育30min 。
20 加入等体积的酚：氯仿( 1 : 1, VIV) ，涡旋20s 。4°C 最大转速离心15min, 分离固相、液相，将液相层转移至一个新的1.5mL 微量离心管中。
21 向液相中加入1/10 体积的乙酸钠( 3mol/L ， pH 5.2) 和2.5 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀，在－20°C 或者更低的温度下放置30min 以上，使PCR 产物沉淀。4°C 最大转速离心30min 。
22 弃去上清。加入1mL 70％乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐类。4 °C 最大转速离心5min 使RNA 沉淀，最大限度地弃去上清(70％乙醇），然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。
23 将RNA 沉淀溶解于100 μL 的无核酸酶水中。利用吸收光分光光度计测量RNA 的浓度。
24 使两条链复性， 生成0.5μmol/L 的dsRNA 溶液：

正义RNA	50pmol
反义RNA	50pmol
复性缓冲液( 10 X)	10 μL
无核酶水	加至100 μL

25 将试管放在热循环仪中， 95°C 1min, 关闭热源使温度缓慢降至室温。
26 按照步骤21 、步骤22 的方法沉淀RNA 。
27 将沉淀溶于水中，制成lμg/μL 的储备液，－8 0 °C 保存。

检查dsRNA 的完整性
28 用0.5 X TBE 缓冲液配制一块1％的琼脂糖凝胶。
29 将dsRNA （步骤27 中得到的）和ssRNA （步骤23 中得到的有义链和反义链，作为对照使用）溶解于1 X 非变性凝胶上样缓冲液中，终浓度为0.1 μg/μL 。
30 每个样品上样5μL, 在0.5 X TBE 缓冲液中进行电泳，恒压75V 。
31 电泳结束后， 室温下用SYBR Gold ( 1 : 10000 溶解于0.5 X TBE 缓冲液） 或者溴化乙锭( 1 : 20000 溶解于0.5 X TBE 缓冲液）染色10 min, 在紫外光下观察RNA 条带。

疑难解答
问题（步骤23) ： 没有检测到转录产物。
解决方案： 更换连接到引物上的T7 启动子（步骤5 ) 。
检查体外转录使用的试剂（步骤14 ) ； 确认所有的试剂都已添加，并且T7 聚合酶有活性。使用新鲜的NTP 和DTT 进行体外转录反应。

问题（步骤31) ： 发现污染条带或与PCR 产物（步骤10 ) 同样大小的条带。
解决方案： 凝胶中有污染条带表明由于RNA 酶的污染导致RNA 降解。要求实验全程都要戴手套，并且要经常更换。使用无RNA 酶的试剂、试管和移液器吸头。使用RNA 凝胶电泳专用的TBE 缓冲液和电泳装置。与PCR 产物（步骤10 ) 同样大小的条带表明DNA酶Ⅰ 失活。对于仍然含有带有模板DNA （步骤23 中） 的体外转录RNA （步骤16 ) 或纯化后的RNA 要用不同批次DNA 酶Ⅰ（来自步骤17 ～ 步骤19 ) 处理，并重复纯化和复性过程（步骤20 ～步骤27 ) ，然后再进行电泳检测dsRNA （步骤28～步骤31 ) 。

配方

复性缓冲液(10 X)

试剂	数量（ 以100 mL 计）	终浓度( 10 X)
乙酸钾( 2mol/L）	50mL	1mol/L
HEPES －氢氧化钾( 1mol/L, pH 7.4 )	30mL	300mmol/L
乙酸镁（1mol/L ）	2mL	20mmol/L
水	补足100mL
室温保存。

Ficoll-Orange G 上样缓冲液(6 X)

试剂	数量（以100mL 计）	终浓度(6X)
Ficoll-400	15g	15% ( m/V)
Orange G	250mg	0 25% (m/ V)
水	补足100mL
分装为1mL, -20 ℃保存。

非变性凝胶上样缓冲液(10 X )

试剂	数量（以100 mL 计）	终浓度( 10 X)
Ficoll-400	15g	15% ( m/V)
二甲苯蓝	250mg	0 25% ( m/V)
溴酚蓝	250mg	0.25% (m/ V)
水	补足100mL
分装为1mL , -20℃ 保存。

PCR 缓冲液( 10 X)

试剂	数量（以100mL 计）	终浓度(10 X)
Tris-HCI ( 1 mol/L, pH 8.3)	10mL	100mmol/L
KCI ( 2mol/L )	25mL	500mmol/L
MgCl2 ( 1 mol/L )	1.5mL	15mmol/L
明胶(Gelatin) ( 2%, m/V)	5mL	0.1% (m/V)
水	补足100mL
分装为lmL , -20℃ 保存。

T7 转录缓冲液( 10 X)

试剂	数量（以100mL 计）	终浓度(10 X)
Tris-HCI ( 1 mol/L, pH 7 9)	40mL	400mmol/L
亚精胺(Spermiodine ) (1mol/L)	2.5mL	25mmol/L
MgCl2 (1mol/L)	26mL	260mmol/L
Triton X-100	1mL	0.1 % (m/V)
水	补足100mL
分装为1mL， －20℃ 保存。