关于使用嘌呤霉素筛选标记(puromycin resistance marker)的慢病毒(lentivirus)或逆转录病毒(retrovirus)进行病毒滴定(virus titration)的 protocol,确实有不少不同的做法,这是因为不同实验室根据自己的系统和需求进行了优化。但是,有一些权威且广泛应用的标准流程可以作为通用参考,下面是整理的一个 …
阅读更多 »验证shRNA的敲除效率时,qPCR引物怎么才能设计在靶标附近
在用 qPCR验证shRNA敲除效率 时,引物设计是非常关键的一步。你提到要“设计在靶标附近”,这个思路是对的,但还需要进一步明确几个关键点。 理解shRNA的作用机制: shRNA经过加工后变成siRNA,通过RNA干扰机制(RNAi),引导RISC复合体结合并切割目标mRNA。 切割点通常位于shRNA的互补区域中间(即靶序列中心)。 qPCR引物设计的 …
阅读更多 »测序正确是不是说明shRNA构建没有问题
测序正确是一个重要的验证步骤,但它不能完全说明shRNA构建没有问题。下面我会具体说明为什么。 测序正确说明了什么? shRNA序列(包括发夹结构、目标序列)与设计一致: 如果你对构建后的质粒进行了Sanger测序,序列结果和你设计的shRNA完全一致,这说明你的克隆步骤(连接、转化等)是成功的。这意味着你至少在DNA水平上构建了正确的序列结构。 但这并不代 …
阅读更多 »请问瞬时转染的效率如何确定?荧光镜下看感觉无法量化和保证每个组别的转染效率完全一致
这是一个很重要也很实际的问题——瞬时转染效率是RNA干扰或质粒表达实验中一个关键变量,但很多人低估了它对结果的影响。 问题核心: 你说得非常对: “荧光镜下看感觉无法量化和保证每个组别的转染效率完全一致。” 用荧光镜看确实是定性评估,不够准确,且不同组别(尤其不同处理条件)可能转染效率不同,导致后续敲低效率、蛋白表达等结果不具可比性。 几种常见的转染效率评估 …
阅读更多 »siRNA转染很有效(蛋白水平明显降低),将siRNA序列构建进慢病毒(shRNA形式)后感染细胞,荧光表达很强,但目标蛋白并未敲低,这是什么原因
你遇到的这个问题在慢病毒(lentivirus)介导的RNA干扰实验中其实挺常见,下面我们逐步分析下可能的原因: 实验现象简述: siRNA转染敲得很有效(蛋白水平明显降低); **将siRNA序列构建进慢病毒(shRNA形式)**后感染细胞; 荧光表达很强(说明病毒成功进入细胞,且有表达); 但目标蛋白并未敲低,几乎没有 knockdown 效果。 可能原 …
阅读更多 »质粒被酶切过还可以电转吗?
可以,但得分情况来看: 如果质粒是线性化了(即被酶切成线状DNA): 可以电转,但是效率明显低于超级螺旋质粒(超螺旋 plasmid,通常是未切割、天然状态下的质粒结构)。 线性质粒在细胞内容易被核酸酶降解,稳定性和转化成功率比超螺旋质粒低很多。 有些时候,比如做基因组编辑(CRISPR knock-in)、整合型表达载体(需要基因组插入时),反而故意使用线 …
阅读更多 »大肠杆菌电转后,4度涂抹到培养基板子上会导致死亡吗?细菌电转后是不是比细胞还脆弱啊?
这个问题问得很实际,也很关键,特别是在做质粒转化实验的时候容易遇到。 回答一:大肠杆菌电转后,4℃下操作是否会导致死亡? 不会直接导致大面积死亡,但确实会影响转化效率。 电转后的大肠杆菌处于一种“受伤”的状态,细胞膜被电击短暂打破,虽然迅速恢复,但暂时很脆弱。 如果在电转后没有及时给予复苏(比如在SOC、LB等液体培养基中摇床复苏30–60分钟),就直接在低 …
阅读更多 »慢病毒倍比稀释测定活性的实验中,DAY2天时,把稀释好的病毒和细胞孵育过夜时,用把细胞原培养基吸取出去吗,还是直接把病毒液添加进去?
好问题!在进行 慢病毒倍比稀释测定病毒滴度(titer) 的时候,DAY2 加入病毒时是否更换培养基,确实是一个关键点,对感染效率有一定影响。下面是两种常见操作方式,以及推荐做法: 推荐操作:先吸掉培养基,再加病毒(常规做法) 流程简述(以DAY2为节点): DAY1:铺板细胞(如293T、HEK293,常用于测滴度); DAY2:感染操作 吸掉旧培养基; …
阅读更多 »293T分别包装两种病毒,浓缩后混合感染鼠CD8+ T细胞可以吗?
原则上可以,具体要看以下几个条件: 步骤可行性: 分别包装:在293T细胞中分别转染两种构建(比如psPAX2 + pMD2.G + 各自的载体),收集病毒上清; 浓缩:超速离心或PEG浓缩,两种病毒分别处理; 混合感染:感染前混合两种浓缩后的病毒,用于感染小鼠CD8+ T细胞。 技术要点: T细胞激活:CD8+ T细胞对逆转录病毒天然不易感染,通常需要先用 …
阅读更多 »逆转录病毒可以共感染吗?
可以。逆转录病毒(如MLV、lentivirus等)可以共感染同一细胞,尤其是不同病毒包装不同的转基因载体时,可以实现共转导(co-transduction),从而使同一细胞获得多个基因。 但要注意: 病毒滴度足够高:每个病毒的MOI(Multiplicity of Infection)需要合适,才有可能让同一细胞被两种病毒都感染。 标记或选择机制清晰:常用 …
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