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细胞增殖检测的最佳方法——CCK8

CCK8, Cell Counting Kit-8,CCK-8试剂含有WST-8(化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐),是近年新开发的一种更新的水溶性四唑盐检测,原理与WST-1类似:在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原成具有高度水溶性的橙黄色甲臜产物(Formazan)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比,用酶联免疫分析仪测定其光吸收值可间接反映活细胞数量,在一定细胞数量范围内甲臜形成的量与细胞数成正比。

操作步骤

  • 在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养(37℃,5% CO2)。
  • 细胞处理(不同实验处理方式不同)
  • 向每孔加入10 μL CCK溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。
  • 将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
  • 用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
  • 若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。

优点
由于CCK法灵敏度高,稳定性好,操作简便,重复性好,且不需要放射性同位素和有机溶剂现已广泛应用于多个领域,如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。

检测方法 MTT XTT WST-1 CCK
甲臜产物的水溶性 差(需加有机溶剂溶解再检测)
产品性状 粉末 2瓶溶液 溶液 1瓶溶液
使用方法 配成溶液后使用 现配现用 即开即用 即开即用
检测灵敏度 很高 很高
检测时间 较长 较短 较短 最短
检测波长 560-600nm 420-480nm 420-480nm 430-490nm
细胞毒性 高,细胞形态完全消失 很低,细胞形态不变 很低,细胞形态不变 很低,细胞形态不变
试剂稳定性 一般 较差 一般 很好
批量样品检测 可以 非常适合 非常适合 非常适合
便捷程度 一般 便捷 便捷 非常便捷

CCK8-2
注意事项

  • 根据所培养细胞的种类和细胞数量来确定细胞培养时间。细胞培养1-4小时后,可先从培养箱中取出,目测或使用酶标仪观察染色程度,若染色不充分,再将细胞放入培养箱中继续培养。
  • 保证培养箱和培养板中间孔的湿度。培养板中间孔的湿度可以使用PBS填充边缘孔的方法来解决。
  • 添加CCK-8试剂时,速度要快,避免药剂在枪头上停留时间过长,对药物浓度产生影响。也可在加样前用培养基稀释CCK-8。
  • 为增加检测数据的准确,可以设定空白对照。在不含细胞的培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时,还应考虑药物的吸收,可在不含细胞,加入药物的培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度作为空白对照。
  • CCK-8试剂的颜色为淡红色,与含酚红的培养基颜色接近,不注意的话容易产生漏加或多加。
  • OD值太低,可以采取2个办法:① 适当增加细胞数量。② 延长加入CCK8试剂后的染色时间。

CCK-8检测细胞增殖实验的灵敏度比MTT、XTT及MTS更高,数据可靠,重复性好,操作简便且无需放射性同位素和有机溶剂,对细胞几乎没有毒性,尤其适合于悬浮细胞高通量药物筛选。

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