英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
1.细胞密度 一般来说，当细胞密度达到60%～80%时进行转染可以取得较高的转染效率，过低或过高都会影响转染效果。 2.细胞状态 这点非常关键，很多时候传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此，为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性，应尽量使用适度传代的细胞系，并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。 还有，尽量选择无 …
阅读更多 »CCK8与射频消融不足诱导的自噬和残余肝细胞癌快速进展研究
目前，射频消融术（RFA）已成为治疗肝细胞癌（HCC）最广泛的方法。然而，越来越多的证据表明，RFA不足（IRFA）的发生可能导致患者体内残留HCC的快速发展，这可能极大地阻碍使用该技术的有效性和患者所获的益处。尽管已经做出了许多努力，但目前的研究文献综述还没有完全阐明导致IRFA后残余HCC快速进展的潜在机制。现分享一篇CCK8（engree …
阅读更多 »western-blot实验结果影响因素
1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。 2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的 …
阅读更多 »细胞转染效率影响因素
1）优化条件：质粒不同，所转染的细胞不同及定量的准确性等因素会导致在一些情况下所做的转染不在该优化条件内。这种情况下需要对质粒转染试剂的配比进行优化。另外，可选用更合适的转染试剂，如Entranster试剂。 2）抑制剂：不要在用于制备DNA-转染试剂复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸 …
阅读更多 »如何做好siRNA转染实验？
为了做好siRNA转染实验，在转染过程中，需要注意以下几点： 1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导 …
阅读更多 »免疫球蛋白G ( IgG) 片段的水解（二）
基本方案2 木瓜蛋白酶水解IgG 获取Fab 片段的大量制备 材料 木瓜蛋白酶 ( 2 X 重结晶悬液 ) 水解缓冲液：0.02mol/L EDTA （ 二钠盐） / 0.02mol/L 半胱氨酸／PBS （新鲜配制，冰上保存<10h) 溶于PBS 中浓度≥1mg/ml 的IgG （ 总量≥5mg ) 碘乙酰胺结晶 PBS, pH8. 0 蛋白A …
阅读更多 »世界上最遥远的距离之荧光定量PCR
世界上最遥远的距离不是天涯海角，而是我天天和你在一起，你却不了解我。 荧光定量PCR常做，相关概念常说，可它们到底啥意思？ 荧光定量PCR中基线、阈值、Ct值、扩增曲线、熔解曲线等基本概念 基线（Baseline）：是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。 荧光域值（threshold）的设定：一般将 PCR …
阅读更多 »提高PCR特异性的策略
1、巣式pcr（Nest-PCR）可增加稀有靶序列的灵敏度；降低了扩增多个靶位点的可能性；提高PCR特异性 2、递减PCR（Touch Down PCR）：前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性；循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2，直到退火温度低于Tm 5 。适合用于AFLP、DNA指纹分析等。 3、热启动PCR：抑制一种基 …
阅读更多 »western-blot化学发光（ECL）时，胶片上条带很弱怎么办？
条带弱的原因可能有以下几个方面： ①. 因为蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成。可适当加大蛋白上样量，也可通过提高抗体稀释度或采用灵敏度更高的发光底物来调整，如英格恩的Enlight-plus。 ②. 蛋白没有充分转移到膜上。转膜后可通过预染Marker判断转膜效率，也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶，判断转膜效率。 ③. 抗体效价 …
阅读更多 »如何提高病毒感染细胞实验效率？
可使用病毒感染增强剂envirus提高病毒的感染效率，下面以慢病毒为例，说一下实验过程。 1.提前一天细胞铺板 提前一天将细胞种植在24孔板中，以感染时细胞融合度在50%左右为宜(悬浮细胞根据需要调整，不要采用过高的细胞密度)。 2.感染 ⑴将2ul的EnvirusTM-LV用25μl无血清稀释液稀释，充分混匀，制成EnvirusTM-LV稀释液。4℃静置5 …
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