英格恩技术的博客 专注转染等细胞和蛋白实验!
常见问题 解决对策两块玻璃板之间灌胶，胶总是不平 玻璃没有洗干净，应该洗得很干净 …
阅读更多 »体内转染（entranster）与GSDMD在I/R损伤中的作用及可能的潜在机制研究
尽管缺血性中风是全世界死亡的主要原因之一，但缺血再灌注（I/R）脑损伤的致病机制仍不清楚。消皮素D（Gasdermin D，GSDMD）是caspase-11（非异常炎症体）和caspase-1（典型炎症体）下游的热致死亡执行的重要因素，可能与I/R损伤有关。现分享一篇体内转染（entranster）与GSDMD在I/R损伤中的作用及可能的潜在机制研究的文献 …
阅读更多 »ECL发光液（enlight）与AMPA受体和巨噬细胞中TNF-α的表达和释放研究
谷氨酸（Glu）是中枢神经系统中一种兴奋性神经递质，并根据其特定的谷氨酸受体发挥多种功能。谷氨酸也是一种营养氨基酸，存在于血液中。谷氨酸受体有两组，它们是离子型受体（IGLURs）和代谢型受体（MGLURs）。IGLURS是根据其对激动剂的选择性分为三个亚型：N-甲基-D-天门冬氨酸受体（NMDA），A-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸 …
阅读更多 »western-blot实验影响因素有哪些？
样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保 …
阅读更多 »细胞转染实验的陷阱
细胞转染是细胞生物学和分子生物学的一种常用的技术手段。而转染效率低下却是实验人员经常遇到的问题，尤其是原代细胞转染，转染难度更大。现分享几个细胞转染实验常见的几个陷阱，望实验人员能够注意。 1.准备不足 做细胞转染的时候，在开展正式实验前要多做预试验，优化转染条件。优化转染条件包括：转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。 2.细 …
阅读更多 »siRNA细胞转染过程常见问题及解答
RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率和总的细胞数量就很重要，一般细胞数量较少时转染效 …
阅读更多 »如何提高病毒感染细胞实验效率？
可使用病毒感染增强剂envirus提高病毒的感染效率，下面以慢病毒为例，说一下实验过程。 1.提前一天细胞铺板 提前一天将细胞种植在24孔板中，以感染时细胞融合度在50%左右为宜(悬浮细胞根据需要调整，不要采用过高的细胞密度)。 2.感染 ⑴将2ul的EnvirusTM-LV用25μl无血清稀释液稀释，充分混匀，制成EnvirusTM-LV稀释液。4℃静置5 …
阅读更多 »siRNA细胞转染过程中应注意事项
为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点： 1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致 …
阅读更多 »悬浮细胞的siRNA转染操作步骤
悬浮细胞的siRNA转染操作步骤，以24孔板siRNA转染为例 1.提前1天细胞种植 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。 2.转染过程 ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μ …
阅读更多 »影响细胞转染的因素
1.细胞密度 一般来说，当细胞密度达到60%～80%时进行转染可以取得较高的转染效率，过低或过高都会影响转染效果。 2.细胞状态 这点非常关键，很多时候传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此，为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性，应尽量使用适度传代的细胞系，并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。 还有，尽量选择无支原体污染的 …
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