英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
1．选择合适的转染试剂 不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然，最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。如英格恩的 …
阅读更多 »支原体污染的7大问题
之前本站发表过一篇关于细胞污染的预防及拯救的文章，部分朋友对于支原体污染有一定的困扰，现就支原体污染常见问题进行解答。 Q1: 支原体污染对细胞有什么危害？ A: 支原体污染后，不会使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞收到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长等，以致影响实验 …
阅读更多 »细胞转染效率低的几个陷阱
细胞转染是细胞生物学和分子生物学的一种常用的技术手段。而转染效率低下却是实验人员经常遇到的问题，尤其是原代细胞转染，转染难度更大。现分享几个细胞转染实验常见的几个陷阱，望实验人员能够注意。 1.准备不足 做细胞转染的时候，在开展正式实验前要多做预试验，优化转染条件。优化转染条件包括：转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。 2.细 …
阅读更多 »从脾脏、胸腺和淋巴结制备小鼠细胞悬液
材料 RPMI-5 或DMEM-5 完全培养基 新鲜分离的小鼠器官: ≤6 周龄的小鼠胸腺； 6 周至6 个月龄的小鼠脾脏和淋巴结 60mmX15mm 培养皿 剪刀和镊子（保存在70 ％乙醇的烧杯中） 装有19G 针头的6ml 注射器 200μm 尼龙滤网 步骤 将新鲜分离的器官放入盛有3ml RPMT-5 或DMEM-5 完全培养基的60mmX15mm培 …
阅读更多 »western-blot实验经验总结
我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变 …
阅读更多 »western-blot实验注意事项
滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。 滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。 因为DEPF膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。 滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。 转移 …
阅读更多 »PCR实验扩增产物出现杂带是什么原因？
可能的原因和对应的解决方案如下： 1.引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。 2.循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。 3.酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。 4.退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的 pcr 扩增。以 2 ℃为梯度设计梯度 PCR …
阅读更多 »免疫球蛋白G (IgG) 的纯化（二）
基本方案2 蛋白A交联琼脂糖凝胶亲和层析 蛋白A 通常用于人（除lgG3外；小鼠lgG1 结合力也较弱）、兔、豚鼠和猪抗体的纯化。 材料 腹水或MAb 上清 PBS, pH8.0 和pH 7.3 1mol/L NaOH 蛋白A 交联琼脂糖凝胶CL-4B 0.1mol/L 柠檬酸， pH 按照所分离的抗体亚类的需要而定（步骤3) 10% (m/V) NaN3 …
阅读更多 »Hela细胞转染后出现死亡是什么原因？
可能有多种原因： 目标蛋白对细胞有毒性，导致细胞死亡； 转染试剂以及DNA用量信息需要优化，否则对细胞具有伤害； 细胞贴壁转染之后没有正常换液。 建议： 考虑对目标蛋白进行截短构建、尝试其他细胞系统； 摸索转染试剂以及DNA用量信息，如果转染试剂毒性太大，可以考虑尝试Entranster转染试剂。 对转染后的细胞进行换液处理，如果细胞状态感觉不够理想，可以考 …
阅读更多 »浅析细胞转染效率低下的原因
1、细胞太少或细胞密度太大 细胞密度对转染效率有一定的影响。不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂，最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法，包括适当的接种量和培养时间等。 阳离子脂质体 …
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