其它

1.细胞密度 　　一般来说，当细胞密度达到60%～80%时进行转染可以取得较高的转染效率，过低或过高都会影响转染效果。 　　2.细胞状态 　　这点非常关键，很多时候传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此，为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性，应尽量使用适度传代的细胞系，并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。 　　还有，尽量选 …

细胞转染效率受多种因素影响，主要因素有下面几个： 1．转染试剂       不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然，最适合的是高效、低毒的转染试剂，如Entranster …

      传统的转染试剂有一定的细胞毒性，在转染过程由于提高细胞的通透性因而不能在培养基中添加抗生素。如，阳离子脂质体。带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞。血清中含有大量的蛋白质，在转染过程中，带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体对核酸的吸附，影响转染效率。另外，使用脂质体等转染试剂时，由于含血清 …

      使用高纯度、无菌和无污染的DNA进行电穿孔实验。质粒DNA要求无内毒素，OD值为1.8-2.0。不建议使用微型核酸制备试剂盒准备DNA，因为它可能含有高水平的内毒素。 不要使用仅用乙醇沉淀法纯化的DNA。乙醇沉淀法中残留的盐会引起电流改变并对电穿孔产生负面影响。 建议DNA的浓度范围为1-5 mg/ml。使用浓度较高的DNA可能会导致与细胞不均匀 …

1.        不合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2.        细胞选择错误 用 …

SDS－PAGE电泳是实验室比较常用的一个实验，关于SDS－PAGE电泳的一些代表性问题，现集中整理一下以供大家参考指正。 聚丙烯酰胺凝胶（PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶，是由丙烯酰胺单体（Acr）和少量的交联剂N，Nˊ-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素）和加速剂（N， N，NˊNˊ-四甲基乙二胺）的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。以此凝 …

      siRNA转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；可以选择细胞毒性小的非脂质体类的转染试剂，如Entranster试剂，另外，如果siRNA所靶向的基因对于维持细胞生长是非常重要的，出现细胞死亡的 …

1）优化条件：质粒不同，所转染的细胞不同及定量的准确性等因素会导致在一些情况下所做的转染不在该优化条件内。这种情况下需要对质粒转染试剂的配比进行优化。另外，可选用更合适的转染试剂，如Entranster试剂。 2）抑制剂：不要在用于制备DNA-转染试剂复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸 …

     悬浮细胞是指细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长，如淋巴细胞。在实验室经常会遇到悬浮细胞的转染，其和贴壁细胞转染还是有很大不同的。     目前大多数实验室用的是脂质体类的转染试剂，脂质体转染是基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作 …

(一)碱裂解法提取质粒 [实验原理] 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复Ph至中 …