其它

       慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 …

小鼠大脑皮层神经元原代细胞培养步骤： 1、 于无菌条件下切取鼠头并以75%酒精浸泡1min，解剖出完整鼠脑； 2、 预冷解剖液中分离去除软膜、血管、取大脑皮质漂洗，用眼科剪将皮质反复剪切成碎块； 3、 移入培养皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2m1，37℃培养箱中消化30min； 4、 将皮层组织碎块移入离心管，弃去剩余消化液，用接种液洗3次，每次洗涤 …

转染试剂 转染中要额外注意的就是转染试剂应该是确认无RNase污染的，而且也尽量避免和质粒DNA转染混用——即使试剂本身兼容DNA和RNA转染，因RNA与DNA大小不同，转染条件不同，所需的试剂也应不同，所以RNA专用的转染试剂会更好一些。比如Entranster-R4000. RNA转染时RNA的用量 RNA转染的用量必须参考RNA转染试剂说明，因为RNA …

悬浮细胞的siRNA转染操作步骤，以24孔板siRNA转染为例 1.提前1天细胞种植 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。 2.转染过程 ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μ …

      首先siRNA由于只有二十几个碱基对，相比DNA几千上万对碱基，小了许多。目前大多数转染试剂都针对比较大的质粒DNA，而非小的RNA分子。用于转染DNA的转染试剂和方法并不完全适用于转染siRNA。     其次，siRNA转染比DNA转染对转染试剂细胞毒性的要求严格。由于转染试剂对细胞的毒性往往是对众多基因直接地或间接地上调或下调的结果，这对于 …

[实验原理] 总RNA，经寡聚(d丁)纤维素亲和层析柱分离出mRNA，以寡聚(d丁)为引物，经反转录合成双链cDNA。先用反转录酶合成第一条cDNA链；经碱降解作用除去RNA模板后用大肠杆菌DNA聚合酶，以第一条链cDNA的3’末端结构为引物合成第二链，最后形成双链cDNA。 [仪器、材料与试剂] (一)仪器和材料 紫外线透射仪、移液枪、琼脂糖凝胶电泳系统 …

我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存。有些时候比蛋 …

·滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。 ·滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。 ·因为DEPF膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。 ·滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的 …

1，  质粒的大小和质量 线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。而线性化DNA转染的整合几率高。质粒太大了转染会困难一些。毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。如果你的质粒正好比较大，又没有经验，选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几率会高一些。有的转染试剂还会提供一些 …

悬浮细胞的siRNA转染操作步骤，以24孔板siRNA转染为例 1.提前1天细胞种植 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。 2.转染过程 ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μ …