英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
对每个基因设计并检测两到四个siRNA序列 为了找到潜在靶位点，扫描靶基因中的AA序列。记录每个AA 3’端19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。潜在靶位点需通过GENBANK数据库的BLAST分析，去除那些与其它基因明显同源的靶位点。如果可能，siRNA应根据mRNA低二级结构的区域设计。 选择低GC含量的siRNA 纯化体外转录siRNA 在转染前要确认 …
阅读更多 »western-blot实验常见问题及解决方案（enlight）
分子克隆中常用的其他酶
一、DNA 聚合酶 分子克隆中的许多步骤都涉及在DNA 聚合酶催化下的DNA 体外合成反应。这些酶作用时大多需要模板，合成产物的序列则与模板互补。大多数聚合酶优先作用于DNA 模板，但也可拷贝RNA ，尽管这时效率较低。最常用的依赖于DNA 的DNA 聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶 I （全酶）、大肠杆菌DNA 聚合酶I 大片段(Klenow 片段）、T4 …
阅读更多 »双脱氧法DNA 测序常见问题
问题 可能原因 解决方法 放射自显影片空白 DNA 聚合酶失活 标记物太旧 用对照引物、模板及试剂进行试验 试剂太旧 替换缺陷试剂 不正确或有缺陷的引物 不正确或有缺陷的模板, 曝光失误（如保留了保鲜膜，凝胶对着胶片的背面等 改正错误 整张放射自显影片太亮／标记物掺入不足 标记物太旧 采用新标记物 酶活性太低 采用 …
阅读更多 »分子生物学常用贮存液的配制
分子生物学常用贮存液的配制 1．30%丙烯酰胺溶液 【配制方法】将29g 丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用滤器（0.45μm 孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH 值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。 【注意】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称 …
阅读更多 »western-blot化学发光（ECL）的特异性差怎么办
特异性差，出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面： 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20 …
阅读更多 »如何对包涵体蛋白进行表达与复性
包涵体即在某些生长条件下，在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 关于包涵体的复性一直是生物制药的瓶颈，包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的 …
阅读更多 »蛋白质浓度的测定
通常用的蛋白质浓度测定方法是Bradford 、BCA 以及在280 nm 处的光吸收。实验室倾向于选择一些特定的方法，在订购新的试剂前先试用实验室的常规方法。Brad ford法是最好的一种可以用来满足所有目的的方法。 不能直接用一种方法的结果与另一种方法进行比较，必须相对浓度来比较，例如，用Bradford 法测量到的牛血清清蛋白的量比其称量的值高两倍。 …
阅读更多 »蛋白质印迹实验过程注意事项
· 滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。 · 滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。 · 因为DEPF膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。 · 滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤 …
阅读更多 »Western blot 中Tween-20的作用是什么？应该怎么用？
Western blot的洗液TBST是实验室常用的配制液体，对于TBST的配方也基本上相残不多，其中配方中就有一种组分是Tween-20，一种黄色或琥珀色澄明的油状液体，具有特殊的臭气和微弱苦味。用移液枪吸取时会有一种滞后感。为什么在Western blot的洗液TBST中要加入这么一种试剂，Tween-20在Western blot 中在发挥什么样的作用 …
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