分子生物学

这个问题问得很实际，也很关键，特别是在做质粒转化实验的时候容易遇到。 回答一：大肠杆菌电转后，4℃下操作是否会导致死亡？ 不会直接导致大面积死亡，但确实会影响转化效率。 电转后的大肠杆菌处于一种“受伤”的状态，细胞膜被电击短暂打破，虽然迅速恢复，但暂时很脆弱。 如果在电转后没有及时给予复苏（比如在SOC、LB等液体培养基中摇床复苏30–60分钟），就直接在低 …

1、巣式pcr（Nest-PCR）可增加稀有靶序列的灵敏度；降低了扩增多个靶位点的可能性；提高PCR特异性 2、递减PCR（Touch Down PCR）：前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性；循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃，直到退火温度低于Tm 5℃ 。适合用于AFLP、DNA指纹分析等。 3、热启动PCR：抑制 …

SDS-PAGE原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 不同蛋白质具有不同的等电点，在进 …

可能的原因和对应的解决方案如下： 1.引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。 2.循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。 3.酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。 4.退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的 pcr 扩增。以 2 度为梯度设计梯度 PCR …

1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这 …

聚丙烯酰胺凝胶必须由丙烯酰胺单体、聚合起始物、催化剂以及合适的盐及缓冲液的混合物聚合起来。 丙烯酰胺与BIS (N, N’ – 亚甲双丙烯酰胺）是形成胶基质的单体。 过硫酸铵启动胶的聚合过程。胶的配方要求10% 以水配制的过硫酸铵溶液。大多数资料显示需要现配现用。但是，10 ％溶液可以在4℃放置数周而没有明显的活性丢失。最多配制10 …

慢病毒感染后未能实现敲降的原因可能有多种。以下是一些可能的原因及其解释： 慢病毒包装质量问题： 病毒滴度较低，导致感染效率不高，可能无法有效转导目标细胞。 病毒颗粒中没有足够的有效载体，影响敲降效果。 靶向序列设计问题： shRNA或sgRNA设计不合理，没有有效靶向目标基因的序列。 目标序列与基因组其他部位的相似性导致脱靶效应，影响敲降效果。 感染条件不佳 …

【实验原理】 真核生物的mRNA分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1×10-5g RNA，理论上认为每克细胞可分离出5～10mg RNA。其中rRNA为75％～ 85％，tRNA占1 …

1． Bradford 工作液 95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰G250，溶解完后再加磷 85%磷酸 52ml 酸，最后超纯水定容至500ml。过滤后置于棕色瓶 考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保存（Bradford不稳定，一周内有效） 2． 裂解液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4% DTT 60 mM Tris—base 4 …