2022年 5月 17日, 星期二
新闻

分子生物学

磷酸钙转染法实验原理及步骤

【实 验 原 理】 磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞,被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达,也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。 【仪器、材料和试 …

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Western-blot化学发光(ECL)时,胶片上条带很弱是什么原因?

条带弱的原因可能有以下几个方面: ①. 因为蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成。可适当加大蛋白上样量,也可通过提高抗体稀释度或采用灵敏度更高的发光底物来调整,如英格恩的Enlight-plus。 ②. 蛋白没有充分转移到膜上。转膜后可通过预染Marker判断转膜效率,也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶,判断转膜效率。 ③. 抗体效价 …

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什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验?

凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一 …

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RNA的种类

dsRNAdsRNA 即双链RNA , 是由两条互补链复性形成的RNA 分子,可以被Dicer 酶切割形成siRNA 。 Endo-siRNAEndo-siRNA 即内源性小干扰RNA (siRNA) ,是一类存在于几乎所有真核生物中的小干扰RNA 分子。 exo-siRNAexo-siRNA 即外源性小干扰RNA (siRNA) ,是指通过体内或者体外技术 …

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基因克隆连接到T载体是不是多此一举?

T载体是TA克隆载体的简称,就是利用载体的T末端和PCR产物的A末段连接而将目的基因克隆到载体中的方法。我们都知道,做基因克隆目的基因连接到载体,使目的基因能够在受体细胞进行稳定遗传。部分朋友是把目的片段先克隆到T载体后再酶切连接目的载体的,有部分朋友就直接将PCR产物酶切连接到能够将目的基因带入受体细胞进行稳定遗传的载体中。那么进行TA克隆到底是不是多此一 …

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揭秘RNAi,缔造实验神话

用siRNA进行transient transfection不稳定,几代细胞以后,症状就会消失,所以在转染几天(1-3)后要立刻抽提蛋白,进行分析。 用质粒中的shRNA进行转染,如果质粒含有抗生素位点,可以进行筛选,获得较稳定的细胞株系,但需要时间较长 用病毒中的shRNA进行感染(infection),抗生素筛选后,可以获得很稳定细胞株系。 瞬时RNAi …

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将DNA 导入细胞和微生物

分离后, DNA 经常被用于导入细胞和微生物,用来观察受体菌表型的改变或收获大批的供体DNA 及其翻译产物。 原核细胞 转化是细菌与分离的DNA 重组后发生遗传基因的改变。转化通常用来扩增克隆的DNA, 另一个常见的用途是获得大量特定的蛋白质——转化了表达载体的细菌将产生大量的DNA 编码的蛋白质。细菌转化主要有两种方法。 与高浓度的钙离子温育,导致细菌的脂 …

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如何提高qPCR反应的灵敏度与特异性?

1. 首先确定模板RNA完整性好,无DNA污染。 2. RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。 3. 为了防止模板降解,在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。 4. 使用适量的模板RNA,模板量太多会降低特异性,太少会导致扩增不出条带或条带太弱。 5. 若模板中有二级结构,可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。 6. 设计引物时,避免在引物3’端含有 …

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DNA 序列测定——化学(Maxam-Gilbert) 测序法

在Maxam 和Gilbert 发展的DNA 化学测序法(1977, 1980) 中,碱基专一性化学试剂在一种或两种特定核苷酸位置上随机断裂已纯化的3’端或5′ 端标记的DNA, 产生4 套寡聚脱氧核糖核苷酸。因为只有末端标记的DNA 片段才能在测序胶的放射自显影图中显示出来,所以只能观察到含有固定末端的片段,这样就产生了4 列DNA …

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离心机的种类

有很多关于离心机类型的描述性术语,但那些不是严格的定义。在实验室中,离心机通常以制造者的名字相称。 高速与超速离心机都带有冷冻装置,之所以需要冷冻是因为高速离心会产生热。其他离心机有带或不带冷冻装置的型号。 台式离心机, 也称为多用途离心机。不一定放在实验台上,反而经常放在桌子底下。 用途:沉淀细胞与细菌、酚抽提。 g 值与每分钟旋转次数: 角式17000 …

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