在体外转录法制备dsRNA(双链RNA)的过程中,确定mRNA的靶区域是关键的一步。以下是一些常用的方法和步骤,以帮助确定mRNA的靶区域: 1. 目标基因的选择 首先,确定你想要抑制或研究的目标基因。你需要有这个基因的完整序列信息(通常从基因数据库中获得,如NCBI)。 2. 设计siRNA或shRNA序列 设计小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(s …
阅读更多 »DNA 凝胶电泳注意事项
DNA胶用来分离、确定或者纯化DNA片段。用于DNA测序反应的测序胶不在这儿讨论。每位实验室成员有不同的制胶方法。 样品准备 6 X 上样缓冲液: 30% (V/V) 甘油, 0.25%(W/V) 溴酚蓝, 0.25% (W/V) 二甲苯腈蓝,蒸馏水配制。贮于-20’C 。 样品缓冲液与DNA在60’C 温育5 分钟。 标准分子/分子 …
阅读更多 »抗体的使用以及储存方式
一、什么是抗体 抗体是一些淋巴细胞直接抵抗外来分子所产生的蛋白质,它们是免疫系统的重要组成成分,是实验室的重要工具。 多克隆抗体是用抗原注射动物产生的,针对相同蛋白质的不同抗原决定簇直接产生的各种不同亲和性的多种免疫球蛋白的混合物。 单克隆抗体是在体外制备的,是免疫淋巴瘤细胞与分泌抗体的浆细胞融合后产生的,整个培养只产生一种抗体(常是IgG) ,直接抵抗外来 …
阅读更多 »常用的蛋白水解酶抑制剂
当细胞被裂解,内容物释放时,蛋白水解酶和其他一些降解的酶也一同被释放,这时候需要在裂解的缓冲液中加入蛋白水解酶。PS: 细胞自己的蛋白水解酶也会降解细胞内的蛋白质。 抑制剂 靶向的蛋白酶 有效浓度 储存浓度 其他 抑蛋白酶肽 丝氨酸蛋白水解酶 0.1-2ug/ml 10mg/ml溶解在PBS中 避免反复冻融 EDTA 金属蛋白水解酶 0.5-2mmol/L …
阅读更多 »微型凝胶电泳后使用溴化乙锭(EB)估算条带中DNA 数量
此方案概述了一个快速定量DNA 的方法,并同时分析其物理状态。溴化乙锭染色后,用UV 灯照射透视法可以发现包含>5ngDNA 的DNA 条带。CCD 照相机拍下未知样品的影像,然后与一系列已知含量标准品进行强度(灰度)对比,从而估计未知样品中DNA的含量。染色凝胶分析是一种快速的同时测量DNA 的数量并分析其物理状态的方式。 SYBR 染料也可用于染色并大致 …
阅读更多 »WB发光检测中常见的问题及解决方法
免疫印迹试验(Western blot)是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。其中较为简单也为大家所普遍接受的Western blot显色方法为底物化学发光法ECL,文章根据发光检测中常见的几种问题现象与各位生物人一起探讨。疫印迹试验(Western blot)是分子生物 …
阅读更多 »磷酸钙转染法实验原理及步骤
【实 验 原 理】 磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞,被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达,也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。 【仪器、材料和试 …
阅读更多 »碱-SDS 质粒小量制备
小量制备可以从细菌培养物中抽提和分析,离心机12 或16 管足够一次制备。 一、材料 5 ml 过夜培养细菌培养物。使用LB培养基加入合适的抗生素培养单克隆菌体,37’C 振荡培养 灭菌的微桩离心管 冰 溶液I (裂解缓冲液, 25 mmol/L Tr的HCI pH8.0, 50 mmol/L葡萄糖, 10 mmol/LEDTA) ,冰上预冷 溶 …
阅读更多 »慢病毒感染细胞后,细胞长满48小时是否可以先传代,再等到72小时再喷霉素筛选吗
通常在进行慢病毒感染后,建议遵循以下操作步骤: 感染后观察细胞状态:感染后一般在48-72小时内可以看到较为明显的表达,但是否开始筛选需要看细胞的状态和感染效率。如果细胞长满了,可以考虑先进行传代,以避免细胞过度拥挤影响生长和感染效果。 喷霉素筛选的时机:喷霉素通常在感染后48-72小时开始筛选,但实际开始筛选的时间取决于感染效率和细胞状态。如果细胞感染后状 …
阅读更多 »导致western Blot发光(ECL)“背景高”的原因有哪些?
Western Blot发光经常有“背景太高”问题,导致“背景高”的原因有很多,主要有以下几个方面: 1. 抗体浓度过高,洗涤不充分,可以造成抗体在膜上的非特异结合,导致高背景。可通过降低抗体稀释度,增加洗膜次数和Buffer用量,或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20加以改善。 2. 封闭不充分,会造成抗体在膜上的非特异结合,导 …
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