蛋白和酶

常见问题 解决对策   两块玻璃板之间灌胶，胶总是不平 玻璃没有洗干净，应该洗得很干净 过硫酸铵和TEMED加量相对较多 加完试剂后应摇匀            总是漏胶 避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损 将两块玻璃板摆放对齐，底部处于同一平面 膜上有明显气泡 操作时将气泡完全排除 靠膜一侧的滤纸应铺平   特异性低 优化一抗 提高一抗和 …

特异性差，出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面： 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20 …

当细胞被裂解，内容物释放时，蛋白水解酶和其他一些降解的酶也一同被释放，这时候需要在裂解的缓冲液中加入蛋白水解酶。PS: 细胞自己的蛋白水解酶也会降解细胞内的蛋白质。 抑制剂 靶向的蛋白酶 有效浓度 储存浓度 其他 抑蛋白酶肽 丝氨酸蛋白水解酶 0.1-2ug/ml 10mg/ml溶解在PBS中 避免反复冻融 EDTA 金属蛋白水解酶 0.5-2mmol/L …

荧光淬灭是Western Blot发光时常见的现象，即加ECL发光液后立刻可以看到很明显的亮光，但亮光很快就消逝了，压完片后条带却很弱，甚至没有条带，发生这种情况的原因可能有以下几个方面: 1. 抗体浓度太高，局部过多的HRP会快速消耗底物，导致荧光信号过强，条带呈灼烧样。可降低抗体上样量。 2. 抗体浓度太低，荧光信号太弱，可能第一次压片能够获得很弱的条带 …

色谱 与DNA 和RNA 一样，蛋白质可以进行常规的分离，或者用色谱法来分离。主要用的色谱法是凝胶过滤、 离子交换层析和亲和层析。 1.  凝胶过滤，基于分子的大小对物质进行分离。        工作原理：固定相中包含有很多的孔，只有较小的分子才可以进入。       填料：葡聚糖（交联右旋糖苷）、Sephacryl （烯丙基葡聚糖和N, N－亚甲双丙烯酰胺 …

1. 剪下一段足够装得下要透析物质的透析袋，在每个末端留下大概2 英寸（总共留下4英寸）来捆绑透析袋。（可以买到特殊的管子来进行微量的透析。）2. 透析袋的两端都要打结，或者用透析夹封住末端。3. 用戴手套的手打开透析袋的一个末端，另一个手拿住透析袋，把样品认真地装入透析袋中。4. 扎住或者夹住透析袋的末端，夹住之前先挤压赶走气泡，检查渗漏，尤其注意末端。5 …

Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。可按照以下步骤操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation) 使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。 2. 电泳(Electrophoresis …

去污剂是蛋白质生命的一部分，用于细胞裂解以及变性蛋白质，但是去污剂会干扰蛋白质水平和蛋白质功能的测定。 要测定含有去污剂的样品中蛋白质的水平，可以有两个选择： 标准曲线的测定中包括相同比例的去污剂。得到一个准确的定量是必须的。去污剂会影响标准曲线的线性读数，你可以稀释样品到线性范围，但是对于低浓度的蛋白质样品这个方法不可行。 用可以带有去污剂的蛋白质测量方法 …

出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面： 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20。 4. …