分子生物学

通常在进行慢病毒感染后，建议遵循以下操作步骤： 感染后观察细胞状态：感染后一般在48-72小时内可以看到较为明显的表达，但是否开始筛选需要看细胞的状态和感染效率。如果细胞长满了，可以考虑先进行传代，以避免细胞过度拥挤影响生长和感染效果。 喷霉素筛选的时机：喷霉素通常在感染后48-72小时开始筛选，但实际开始筛选的时间取决于感染效率和细胞状态。如果细胞感染后状 …

1.探针的设计与合成 根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82，以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，回收纯化。 引物编号 引物序列 长度 p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp p82 GCTCAAACAGTGATGCCAGT 20 bp 目的片段克隆1）在无菌离 …

表1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液 　 不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml） 溶液成分 5 10 15 20 25 30 40 50 6% 水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30%丙烯酰胺溶液 1 2 3 4 5 6 8 10 1.5 mol/L Tris (pH …

在用 qPCR验证shRNA敲除效率 时，引物设计是非常关键的一步。你提到要“设计在靶标附近”，这个思路是对的，但还需要进一步明确几个关键点。 理解shRNA的作用机制： shRNA经过加工后变成siRNA，通过RNA干扰机制（RNAi），引导RISC复合体结合并切割目标mRNA。 切割点通常位于shRNA的互补区域中间（即靶序列中心）。 qPCR引物设计的 …

双脱氧法或酶法利用DNA 聚合酶合成单链DNA 模板的互补拷贝，这一方法最先由F. Sanger 及其合作者发展而来。DNA 聚合酶不能起始DNA 链的合成，而是在复性于“模板“DNA 的引物的3 ‘端上进行链的延伸（图1) 。链的延伸是在引物生长端的3′ 羟基掺入脱氧核糖核苷酸。双脱氧测序法利用了DNA 聚合酶能以2′, …

条带弱的原因可能有以下几个方面： ①. 因为蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成。可适当加大蛋白上样量，也可通过提高抗体稀释度或采用灵敏度更高的发光底物来调整，如Enlight-plus发光液等。 ②. 蛋白没有充分转移到膜上。转膜后可通过预染Marker判断转膜效率，也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶，判断转膜效率。 ③. 抗体效价 …

原位PCR 在科学研究中，每一项新技术的创立都会带来一系列新的研究成果问世，从而推动着各学科的发展。纵观形态研究领域，50年代电子显微镜引入形态学观察领域，带来了从细胞水平到亚细胞水平的深入研究；60-70年代，免疫组织化学与免疫细胞化学技术的广泛应用，又将观察的水平由亚细胞结构推向了蛋白质分子水平，使细胞内众多的活性物质得以进行细胞或亚细胞水平的定位，对医 …

酚抽提通常用来对DNA 或RNA 样品进行蛋白质的去除。酚与水不互溶，当它们混合时会形成两相，水相和酚相。当含有DNA 的水溶液与酚混合时，蛋白质会进入酚相，再将含DNA 的水相取出进行再抽提和乙醇沉淀浓缩。 一、材料 抗有机溶剂的塑料管，尝试尽可能小的体积，大多数的抽提可以在微量离心管中进行。 TE 饱和的酚：氯仿：异戊醇(25 : 24:1) 氯仿：异戊 …

Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。可按照以下步骤操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation) 使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。 2. 电泳(Electrophoresis …

【实 验 原 理】 磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。 【仪器、材料和试 …