其它

1.如为贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或2×106-4×106细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。 2.用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。 3.培养基中的血清 在开 …

  我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变性，再分装保存 …

下面以Entranster-R4000试剂为例，说一下shRNA转染步骤（24孔板） 1.提前1天细胞种植 贴壁细胞：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30％左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那 …

1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致siRNA转染实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮 …

1．选择合适的转染试剂       不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然，最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。如Entr …

材料 小鼠 HBSS 洗涤缓冲液 MACS 缓冲液 CD45R（B220) 磁珠 RPMI-10 完全培养基 autoMACS 系统和分选柱 30μm 尼龙网(BD) 或40μm 预分离滤膜 步骤 用2 只小鼠的脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞。 将细胞在10ml HBSS 洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数 。 将细胞悬液在4℃，200g 离心10 min …

Hippo信号通路是一条细胞抑制生长性信号通路，在进化过程中非常保守，多细胞动物果蝇、小鼠、哺乳动物中都存在Hippo信号通路。近年来关于Hippo信号传导通路的研究十分活跃，处于国际科技发展的前沿。 Hippo信号通路是一条细胞抑制生长性信号通路，在进化过程中非常保守，多细胞动物果蝇、小鼠、哺乳动物中都存在Hippo信号通路。最早研究人员在果蝇中发现Hip …

细胞转染效率低的原因可从以下几方面找： 1.质粒DNA或混和液中含有血清。 对策：用无血清培养基或Opti-MEM培养基。 2.质粒DNA和转染试剂的比率不是最优 对策：对大多数细胞而言，质粒DNA和转染试剂的比例为1:2-1:3，一般要做优化实验，比例从1:0.5-1:5 逐一检测。 3.质粒DNA 已部分降解或质量不够好 对策：用好的质粒纯化试剂确保质粒 …

1）优化条件：质粒不同，所转染的细胞不同及定量的准确性等因素会导致在一些情况下所做的转染不在该优化条件内。这种情况下需要对质粒转染试剂的配比进行优化。另外，可选用更合适的转染试剂，如Entranster试剂。 2）抑制剂：不要在用于制备DNA-转染试剂复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸 …

可能有多种原因： 目标蛋白对细胞有毒性，导致细胞死亡； 转染试剂以及DNA用量信息需要优化，否则对细胞具有伤害； 细胞贴壁转染之后没有正常换液。 建议： 考虑对目标蛋白进行截短构建、尝试其他细胞系统； 摸索转染试剂以及DNA用量信息，如果转染试剂毒性太大，可以考虑尝试Entranster转染试剂。 对转染后的细胞进行换液处理，如果细胞状态感觉不够理想，可以考 …