体外培养的血管内皮细胞已广泛应用于血管疾病、血管修复、肿瘤血管形成等基础研究及临床研究中。体外培养的血管内皮细胞,仍可保持血管内皮细胞的特征,如表达VIII因子、怀布尔-帕拉德小体(Weibel-Palade body ) 、内皮细胞特异性抗原和IV 型胶原等,还可在三维培养体系或特定诱导条件下形成血管样结构。体外培养的血管内皮细胞生长形成单层后,会表现出接 …
阅读更多 »电转染试剂(Entranster-E)转染Huh7细胞效果图
高滴度反转录病毒和慢病毒载体的制备
一、试剂 CaCl2 溶液( 2mol/L )、完全培养基、DMEM 培养基、乙醇(或异丙醇) (70% )、胎牛血清( FBS )、HBS 溶液(2X)、HEPES (2.5mmol/L, pH 7.3)、OptiMEM+ 1 %青霉素/链霉素( P/S )、OptiMEM , 无P/S、pCMVDΔR8.91 质粒、pUMVC 质粒、pVSV- G 质粒 …
阅读更多 »细胞电转染实验注意事项
选择合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 细胞的选择 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2d)。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛,表面结构致密比稳定 …
阅读更多 »30个关于CCK-8的Q&A
Q1: 一个孔中应接种多少个细胞? A1: 当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。 Q2: 能否用3 …
阅读更多 »RNA转染效率影响因素
1.转染试剂 转染中要额外注意的就是转染试剂应该是确认无RNase污染的,而且也尽量避免和质粒DNA转染混用—即使试剂本身兼容DNA和RNA转染,因RNA与DNA大小不同,转染条件不同,所需的试剂也应不同,所以RNA专用的转染试剂会更好一些。比如Entranster试剂. 2.RNA转染时RNA的用量 RNA转染的用量必须参考RNA转染试剂说明,因为RNA和 …
阅读更多 »siRNA转染效率不理想的原因有哪些?
siRNA转染效率不理想,常见的原因有: 1. RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记,决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件,建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调,但未成功转染的细胞却不受影响,这时转染效率 …
阅读更多 »G418筛选转染克隆的注意事项
G418作为稳定转染通用的一种筛选方式,在进行筛选前应该要注意几点: 1. G418的浓度:G418是一种氨基糖苷类似物,它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。因此在筛选过程中G418的浓度将对转染细胞的筛选产生很大的影响。在筛选之前最好进行条件优化确定最佳筛选浓度。尽管文献有报道筛选浓度,最好还是要自己亲自做一下筛选浓度的确定。 2. …
阅读更多 »RNA转染效率低的原因是什么?
RNA转染效率低,可能的原因: · 转染试剂不适合。建议选择RNA专用转染试剂,如Entranster试剂。 · 转染试剂和RNA的量不够,或者比例不对。优化实验条件,调整试剂和RNA用量,优化二者比例。 · 检测时间有问题。适当调整检测时间。 · RNA质量问题。选择纯度高的RNA。 · 细胞状态不佳。调整细胞状态,调整细胞融合度。
阅读更多 »细胞转染效率不可重复的原因
细胞相比转染效率不可重复原因: 1.细胞融合度不同。保证同样的接种量及同样的时间。 2.细菌污染。可使用Entranster试剂,培养基可加抗生素,避免细胞污染。 3.细胞传代次数太高了。可重新复苏一管新的细胞。 4.血清质量不稳定。用同一批号的血清。
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