英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
1.转染试剂 转染中要额外注意的就是转染试剂应该是确认无RNase污染的，而且也尽量避免和质粒DNA转染混用—即使试剂本身兼容DNA和RNA转染，因RNA与DNA大小不同，转染条件不同，所需的试剂也应不同，所以RNA专用的转染试剂会更好一些。比如Entranster试剂. 2.RNA转染时RNA的用量 RNA转染的用量必须参考RNA转染试剂说明，因为RNA和 …
阅读更多 »转染siRNA后，可以收集细胞重新铺板吗？
转染siRNA后，通常是会影响细胞的基因表达，但是否可以重新铺板要考虑几个因素。一般情况下，如果转染后需要重新铺板，建议采取以下步骤： 转染后的时间点：siRNA的效果一般需要在转染后24-48小时才能显现，因此在这个时间段内，你不应该轻易处理细胞。若重新铺板，需要确保转染后的时间足够，能让siRNA充分发挥作用。 细胞状态：如果在转染后细胞健康状况良好，并 …
阅读更多 »悬浮细胞的siRNA转染步骤
悬浮细胞的siRNA转染操作步骤，以24孔板siRNA转染为例 1.提前1天细胞种植 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。 2.转染过程 ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μ …
阅读更多 »siRNA表达载体的构建成功要点
对每个基因设计并检测两到四个siRNA序列 为了找到潜在靶位点，扫描靶基因中的AA序列。记录每个AA 3’端19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。潜在靶位点需通过GENBANK数据库的BLAST分析，去除那些与其它基因明显同源的靶位点。如果可能，siRNA应根据mRNA低二级结构的区域设计。 选择低GC含量的siRNA 纯化体外转录siRNA 在转染前要确认 …
阅读更多 »为什么我的细胞转染效率低？
1）优化条件：质粒不同，所转染的细胞不同及定量的准确性等因素会导致在一些情况下所做的转染不在该优化条件内。这种情况下需要对质粒转染试剂的配比进行优化。另外，可选用更合适的转染试剂，如Entranster试剂。 2）抑制剂：不要在用于制备DNA-转染试剂复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸 …
阅读更多 »细胞转染实验的建议
1.如为贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或2×10^6-4×10^6细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。 2.用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。 3.培养基中的血清 …
阅读更多 »电转染试剂（Entranster-E）转染Huh7细胞效果图
问：现在是将构建好的质粒电转入到自制的感受态细胞里，质粒有10000bp，是90μL感受态细胞中加3.5μ质粒。我之前有电转过6000多bp的质粒，过夜培养可以长菌的。但是这个10000bp的质粒过夜培养没有单菌落，延长培养时间后有个别单菌落，但是挑单菌落到LB中并不浑浊。这种情况我是应该调整一下电转程序还是改一下加入质粒的量呢？
以下是详细的优化建议： 优化质粒用量（首要调整）： 问题： 你目前使用的是3.5µL质粒加入90µL感受态细胞。关键在于质粒的浓度（ng/µL），而不是体积。 3.5µL 对于90µL感受态细胞来说体积不小，如果质粒浓度较高，实际DNA量可能大大超过电转最优范围。 原理： 过量的DNA会导致电击时产生过多的热量和离子效应，严重降低转化效率，尤其对大质粒（&g …
阅读更多 »体外培养细胞的一般性质（四）
体外培养细胞的增殖特点 从培养时开始，培养物可从组织块培养的外迁细胞中获得，也可通过酶消化或机械方法分散组织获得。不管采用何种方法获得细胞，原代培养是一系列细胞选择过程的第一步，其最终结果是产生一个相对均一的细胞系。细胞从组织块培养中迁移出来的能力是选择的条件之一； 而对分散的细胞来说，只有那些在离散后黏附到了培养器皿底面上生存下来的细胞， 或悬浮时能存活的 …
阅读更多 »跨膜蛋白TMEM59在tau蛋白病（如阿尔茨海默病）中的作用机制
文献标题： TMEM59 deficiency activates chaperone-mediated autophagy and ameliorates disease-like pathologies in tauopathy model mice （TMEM59缺乏激活伴侣介导的自噬，改善tau病模型小鼠的疾病样病理） 期刊：Alzheimer’s …
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