分子生物学

双脱氧测序法速度快。引物的复性和测序可以在60~90 min 内完成。可以同时制备大量的单链或双链测序样品。如果用35 S标记的dNTP 测序，这种方法可以提供极好的（电泳）条带的分辨率。其主要缺点是模板的组成或二级结构有时会导致测序过早地终止。虽然和Klenow 片段相比，有其他的聚合酶可以减轻这个问题，但有些DNA 序列还是无法用双脱氧法精确地测出来。 …

1. 首先确定模板RNA完整性好，无DNA污染。 2. RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。 3. 为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。 4. 使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。 5. 若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。 6. 设计引物时，避免在引物3’端含有 …

小RNA 克隆和高通量测序的结合是纯化和鉴别细胞或组织中小RNA 的有效先进技术。本方案描述了用于Illumina Genome Analyzer 高通量分析的19 ~ 29 个核苷酸小RNA 的克隆方法，通过聚丙烯酰胺凝胶从总RNA 样品中分离纯化小RNA, 并进行两步连接反应：小RNA3′ 端与5′ 腺苷酸DNA 连接物的连接；以 …

• 滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。 • 滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。 • 因为DEPF膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。 • 滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤 …

非小细胞肺癌（NSCLC）占各种肺癌的85%。肺腺癌（LUAD）是NSCLC的主要亚型，其特点是高转移和高死亡率。NSCLC患者的低生存率主要是由于远处转移，占癌症相关死亡的90%。尽管许多治疗策略已经得到应用，但NSCLC的预后仍令人不太满意。缺乏适当的生物标志物和准确的治疗目标以及化疗药物的毒性导致了肺癌的疗效不佳。因此，探索LUAD发生和发展的分子机制 …

1、Western Blot原理 Westernblot的原理是蛋白质在电力场的作用下，由大到小的进行排列，利用电泳进行分离和富集。拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体（一抗）特异性识别并与之结合。在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。 Westernblot显色的方法主要有以下几种：（1）放射自显影，（2）底物化学发光E …

一．样品制备 1．PCR扩增并检测。根据不同的引物挑选适合的退火温度进行PCR扩增。扩增产物用2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量3-5ul。PCR产物为10ng/nl左右为最佳。 2．PCR产物与变性buffer混合。在干净的PCR管底部加入5ul  SSCP上样缓冲液（变性缓冲液），然后在缓冲液中央加入PCR扩增产物。按照经验，扩增效果在琼脂糖胶 …

RNA 凝胶是用Northern 印迹的方法来分析RNA 。mRNA 大约只占总RNA 的5% ，在溴化乙锭染色的胶上看不到，因此mRNA 必须用标记探针来检测。 ＊样品制备 RNA 样品在电泳之前及电泳过程中必须是变性的，否则不能精确测定分子质量。变性是由甲醛与甲酰胺来完成的，也可用乙二醛和二甲亚砜或甲基苯（不推荐）。 MOPS 胶的样品缓冲液： 0.75 …

PCR PCR是很多科研者进入实验室做的第一个分子实验，名字听起来很高级，其实操作起来流程还是比较清晰明了，容易上手。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction），简称PCR，用于放大特定的DNA片段，也可看作生物体外的特殊DNA复制。其中使用的Taq酶是1976年从温泉中的细菌分离出来的。它的特性在于能耐高温，是一个很理想的酶。PC …

RNA提取原理 RNA提取时，加氯仿后分三层：水相(含rna,可能还有少量DNA），中间白色薄层（应该是蛋白和DNA），下层有机相（氯仿和蛋白等） 氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DN …