英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
保存方法的选择取决于几个因素，包括蛋白质内在的稳定性、所需的保存时间的长短和对于防止破坏所要求的程度。这些因素有很大的变异性，但是，在大多数情况下都应当遵守以下常规的准则。 如果仅仅是要将小批量的纯化蛋白质保存约几天的时间，那么通常只要以非冷冻的溶液形式4°C保存即可，如果需要保存较长的时间，或如果有明显的蛋白质降解（如可见的沉淀物或不可接受的功能损失），那 …
阅读更多 »导致western Blot发光（ECL）“背景高”的原因有哪些？
Western Blot发光经常有“背景太高”问题，导致“背景高”的原因有很多，主要有以下几个方面： 1. 抗体浓度过高，洗涤不充分，可以造成抗体在膜上的非特异结合，导致高背景。可通过降低抗体稀释度，增加洗膜次数和Buffer用量，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20加以改善。 2. 封闭不充分，会造成抗体在膜上的非特异结合，导 …
阅读更多 »反转录定量PCR 分析小RNA
Northern 杂交可以揭示小RNA 的表达水平，同时也可揭示小RNA 的长度，并且是小RNA 验证和定量的标准。然而， Northern 杂交不能用来检测低丰度小RNA, 也不能检测大量的小RNA 种类。相比之下，定量RT-PCR 更加敏感并且可以适用于高通量处理（图1) 。 图1 小RNA 定量RT-PCR 分析流程图。 试剂 mirVana miRN …
阅读更多 »mRNA的分离
mRNA 在细胞总RNA 中占较小的比例，大量的是核糖体RNA。真核生物的mRNA分离方法利用了大多数mRNA 存在多聚腺苷酸尾巴（有一些mRNA 没有多聚腺苷酸的尾巴）。Poly(A) RNA 可以结合在有多聚寡核苷酸(dT) 的树脂上，在高盐的条件下寡聚胸苷酸－纤维素可以结合PolgA-mRNA, 在低盐的情况下洗脱。这种方法可以批量或者在一个小柱子上操 …
阅读更多 »western-blot实验注意事项
• 滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。 • 滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。 • 因为DEPF膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。 • 滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。 …
阅读更多 »cDNA文库构建分为哪些阶段？
cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。cDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。 cDNA文库的构建 …
阅读更多 »mRNA的分离纯化原理
【实验原理】 真核生物的mRNA分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1×10-5g RNA，理论上认为每克细胞可分离出5～10mg RNA。其中rRNA为75％～ 85％，tRNA占1 …
阅读更多 »SDS-PAGE蛋白质样品的制备
将收集的各样品加入等体积的2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm离心10min，取上清-20℃保存备用。 SDS-PAGE蛋白质电泳 1）按照电泳装置的使用说明，装好洁净干燥的玻璃板。 2）分离胶的制备 按下列成分配制10mL 12%分离胶： ddH2O 30%丙烯酰胺混合液 1.5M Tris …
阅读更多 »揭秘RNAi，缔造实验神话
用siRNA进行transient transfection不稳定，几代细胞以后，症状就会消失，所以在转染几天（1-3）后要立刻抽提蛋白，进行分析。 用质粒中的shRNA进行转染，如果质粒含有抗生素位点，可以进行筛选，获得较稳定的细胞株系，但需要时间较长 用病毒中的shRNA进行感染（infection），抗生素筛选后，可以获得很稳定细胞株系。 瞬时RNAi …
阅读更多 »DNA 序列测定——双脱氧( Sanger ) 测序法
双脱氧法或酶法利用DNA 聚合酶合成单链DNA 模板的互补拷贝，这一方法最先由F. Sanger 及其合作者发展而来。DNA 聚合酶不能起始DNA 链的合成，而是在复性于“模板“DNA 的引物的3 ‘端上进行链的延伸（图1) 。链的延伸是在引物生长端的3′ 羟基掺入脱氧核糖核苷酸。双脱氧测序法利用了DNA 聚合酶能以2′, …
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