分子生物学

1、概述 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. K …

该方案是简单而且得到广泛应用的、利用PCR 模板制备双链RNA 的体外转录反应。该方法制备的dsRNA 可以用于在某些细胞或者组织中诱发RNA 干扰。 试剂 琼脂糖凝胶( 1 %)复性缓冲液( 10 X)ATP 、CTP 、GTP 、UTP （ 每种100mmol/L )二硫苏糖醇( DTT ) ( 1mol/L)DNA 分子质量标准dNTP 混合液，每种1 …

一．样品制备 1．PCR扩增并检测。根据不同的引物挑选适合的退火温度进行PCR扩增。扩增产物用2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量3-5ul。PCR产物为10ng/nl左右为最佳。 2．PCR产物与变性buffer混合。在干净的PCR管底部加入5ul  SSCP上样缓冲液（变性缓冲液），然后在缓冲液中央加入PCR扩增产物。按照经验，扩增效果在琼脂糖胶 …

出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面： 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20。 4. …

在用 qPCR验证shRNA敲除效率 时，引物设计是非常关键的一步。你提到要“设计在靶标附近”，这个思路是对的，但还需要进一步明确几个关键点。 理解shRNA的作用机制： shRNA经过加工后变成siRNA，通过RNA干扰机制（RNAi），引导RISC复合体结合并切割目标mRNA。 切割点通常位于shRNA的互补区域中间（即靶序列中心）。 qPCR引物设计的 …

在Western Blot实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确；或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差。所以一般的Western Blot实验都需要进行内参设置。 内参即是内部参照(Internal Control)，Western Blot实验中选择内参作为参照体系对于实验结果的分析具有很好的说明性。对于哺乳动物细胞表达来说，内参一般是指由管家 …

近些年来，随着PCR 技术的出现，以及DNA 克隆和测序方法的发展，对大量质粒载体和重组子的需求也大大减少。因此，本方案曾一度广泛应用，但已经被更为快速和简便的柱纯化方法代替。在本方案中，通过碱裂解法的放大( Bimboim and Doly 1979 ) ，质粒DNA 可从清亮的细菌裂解物中通过含有溴化乙锭的CsCl 梯度离心来进行纯化。 无论是高拷贝数的 …

Western Blot是检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化的首选方法，也是实验室常见的实验方法。 完整的Western实验过程比较长，做一次Western也不容易。有结果当然是好的，没有结果也是常有的事，出现各种烦心结果也是时有发生。其中最常见的一种就数显色后背景高了。背景高，目的蛋白颜色对比不明显，要么看不清，图片展示不理想，更 …

核心原则 标准物理滴度测定：强烈推荐使用293T细胞。 功能性滴度测定/特定应用验证：使用你的目标细胞。 详细解释 为什么推荐293T细胞测定物理滴度？ 高易感性： 293T细胞对慢病毒感染非常敏感，因为它们高表达慢病毒进入所需的受体（如LDL受体）。 高转导效率： 它们通常能达到非常高的转导效率（>80%甚至90%+），这使得检测阳性细胞、计算滴度变 …

cDNA文库的构建分为六个阶段： 阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链 1．在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成： poly(A)+RNA (1μg/μl)    10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl)     1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃)     2.5μl 1mol/L KCl 3.5μl …