本方案介绍一种通过试剂向果蝇S2 细胞转运siRNA 以触发RNA 干扰的有效方法。本方案适用于24 孔板内培养的细胞。如果使用其他规格的多孔板、培养瓶或者培养皿,需要根据培养孔的表面积换算细胞密度和试剂用量(表1 ) 。 表1 果蝇细胞转染所用细胞, 转染试剂和siRNA (或者ASO) 的体积 培养板或培养皿 24孔 12孔 6孔 6cm 10cm 每孔 …
阅读更多 »通过转染双链siRNA 在哺乳动物细胞中进行RNA 干扰
长链dsRNA 不能用于多数哺乳动物细胞中,这是由于它能诱导干扰素反应而引发基因表达和细胞凋亡的变化。本方案介绍了一种向哺乳动物细胞中转入短的双链siRNA 的方法,双链siRNA 因其长度过短而不能引起与dsRNA 相关的序列非特异性反应。本方案适用于24 孔板中生长的细胞。如果使用了其他规格的多孔板、培养瓶或者培养皿,则需要根据培养孔的表面积换算细胞密度 …
阅读更多 »动物实验系列篇章之一——实验动物的抓取和固定
在进行实验时,为了不损伤动物的健康,不影响观察指标,并防止被动物咬伤,首先要限制动物的活动,使动物处于安静状态,工作人员必须掌握合理的抓取固定方法。抓取动物前,必须对各种动物的一般习性有所了解。操作时要小心仔细、大胆敏捷、熟练准确、不能粗暴,不能恐吓动物,同时,要爱惜动物,使动物少受痛苦。 一、小鼠 小鼠性情较温顺,一般不会咬人,比较容易抓取固定。通常用右手 …
阅读更多 »G418筛选转染克隆的注意事项
G418作为稳定转染通用的一种筛选方式,在进行筛选前应该要注意几点: 1. G418的浓度:G418是一种氨基糖苷类似物,它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。因此在筛选过程中G418的浓度将对转染细胞的筛选产生很大的影响。在筛选之前最好进行条件优化确定最佳筛选浓度。尽管文献有报道筛选浓度,最好还是要自己亲自做一下筛选浓度的确定。 2. …
阅读更多 »为什么脂质体转染试剂细胞毒性大?
细胞生物学的战友,应该对细胞转染不陌生,没做过也见别人做过。有个问题想跟大家讨论一下,就是脂质体毒性的问题。我们都知道做一次细胞转染不容易,从准备细胞到目的细胞筛选,过程相当繁琐。所以如何提高转染效率成为了关键,但是常用的脂质体转染要求无血清转染,而且有很大的细胞毒性,对转染效率和实验结果都会产生影响,那为什么脂质体转染试剂毒性这么大? 已有众多的文献报道, …
阅读更多 »细胞转染应该什么时候加抗生素?
细胞转染分为瞬时转染和稳定转染。瞬时转染外源核酸不整合到宿主染色体中,在短时间内在基因或蛋白水平产生较高的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。稳定转染是相对需要建立某些基因整合到染色体DNA的细胞系来说的,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B 磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选, …
阅读更多 »动物实验系列篇章之四——实验动物的除毛、给药方法
一、实验动物的除毛 在动物实验中,被毛有时会影响实验操作与观察,因此必须除去。除去被毛的方法有剪毛、拔毛、剃毛和脱毛等。 (一)剪毛法:剪毛法是将动物固定后,先用蘸有水的纱布把被毛浸湿,再用剪毛剪刀紧贴皮肤剪去被毛。不可用手提起被毛,以免剪破皮肤。剪下的毛应集中放在一容器内,防止到处飞扬。给狗、羊等动物采血或新生乳牛放血制备血清常用此法。 (二)拔毛法:拔毛 …
阅读更多 »Plos one 2015:肺癌细胞凋亡的调控——ENTPD5
肺癌是发病率和死亡率增长最快,对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高。 肺癌被认为是一种遗传性疾病,其中异常的内源性致病基因的表达造成基因组不稳定,增强肿瘤细胞的活力和侵袭性。尽管成功治疗原发性恶性肿瘤,仍有在1/4以上的术后患者复发、转移。 ENTPD5是一种内质网酶,水解UDP为UMP,促进蛋白的N …
阅读更多 »EXP BIOL MED 2015 : 冠状动脉微栓塞! PDCD4/NF-κB有关?
广西医科大学附属第一医院心内科的老师在临床实践中发现,冠状动脉微栓塞(CME)是急性心肌梗死的常见并发症,发生率约10%~20%,是影响微心肌微循环灌注的主要原因。 NF-κB激活是CME引起的心肌炎的重要因素。在早期的研究中,广西医科大学附属第一医院心内科的老师就发现,Pdcd4介导的信号通路在CME引起的炎症可能发挥一个重要的角色。 在研究中,老师们使用 …
阅读更多 »动物体内转染需要哪些条件?
1.每次动物实验,需要准备什么东西,器材? ①转染的核酸,如siRNA,miRNA,mimic、inhibitor,也可以转染DNA。 ②转染试剂和动物。 ③进行注射的器材。 2.可以转染的核酸都有什么?细胞实验的核酸可以用吗? 可以转染小片断RNA如siRNA,miRNA,mimic、inhibitor,也可以转染DNA。进行体外细胞实验的核酸就可以。但要 …
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