1. 电场强度要合适 合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 细胞状态要好 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2 …
阅读更多 »贴壁细胞的分瓶操作步骤
1.从细胞单层吸出培养基。2. 缓慢加入37’C 温浴的PBS 或不含血清的培养基,让培养基沿容器壁流下,注意不要滴在细胞上,以免冲掉附着不牢的细胞。3. 再吸出PBS 或培养基。4. 加入含0.25 %胰蛋白酶的PBS, 加入蜇以刚刚没过细胞为宜。5. 立即吸去胰蛋白酶,停留在细胞上的时间为10 ~ 30s(可以用不含血清的旧培养基多洗细胞几次 …
阅读更多 »如何长期维持你的细胞株?
给养 (给予新鲜的培养基) ,细胞生长过程中会消耗培养基中的某些必需因子,必须更换培养基。 分瓶 (传代、细胞数批减少),细胞数量不断增长,超出容器和培养基的负荷。(PS: 培养和传代是同时进行的,很难只进行一个而不进行另一个操作。) 冻存 细胞株都必须分装冻存样品。可以作为备用,防止细胞表型的漂变 …
阅读更多 »为什么脂质体细胞转染试剂会造成细胞毒性?
已有众多的文献报道,脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的上调或下调。如参与PKC(蛋白激酶C)通路调节(Biochemistry.1992 Sep 22;31(37): 9025-30);如抑制ATP酶的活性(Biochim Biophys Acta.2008 Apr;1777 …
阅读更多 »如何构建siRNA表达载体?
siRNA表达载体构建可以:(1)作为后基因组时代基因功能分析的有力工具;(2)应用于基因组学、细胞信号传导通路分析;(3)用于药物靶点筛选、疾病治疗。 实验方法原理: 多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段小的发夹RNA(shorthairpinRNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动 …
阅读更多 »怎样提高悬浮细胞的siRNA转染效率?
悬浮细胞是指细胞生长不依赖支持物表面,在培养液中呈悬浮状态生长,如淋巴细胞。在实验室经常会遇到悬浮细胞的转染,其和贴壁细胞转染还是有很大不同的。 目前大多数实验室用的是脂质体类的转染试剂,脂质体转染是基于电荷吸引原理,先形成 …
阅读更多 »转化细胞在软琼脂中的生长
恶性转化的细胞在许多方面不同于其相应的正常细胞,主要不同在于它们失去了接触抑制生长,获得永生性和在动物宿主体中形成肿瘤的能力。软琼脂培养可作为体外检测细胞转化和致瘤性的替代方法。 材料 2% (w/ v) 琼脂 基础营养培养基,如DMEM ,含24. 6 %和20% (v/ v) 胎牛血清 单细胞悬液 12 孔培养板 15ml 聚碳酸酣锥形离心管 ,灭菌 对 …
阅读更多 »G418筛选转染克隆的注意事项
G418作为稳定转染通用的一种筛选方式,在进行筛选前应该要注意几点: 1. G418的浓度:G418是一种氨基糖苷类似物,它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。因此在筛选过程中G418的浓度将对转染细胞的筛选产生很大的影响。在筛选之前最好进行条件优化确定最佳筛选浓度。尽管文献有报道筛选浓度,最好还是要自己亲自做一下筛选浓度的确定。 2. …
阅读更多 »细胞电转染实验效率低的原因是什么?
细胞电转染实验效率低的原因一般有以下几点: 1. 不合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 细胞选择错误 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2d …
阅读更多 »siRNA细胞转染常见问题及解答
问:siRNA导入细胞有哪些方法,哪种最好? 答:siRNA导入细胞有以下几种方法:化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素:细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说化学转染技术是最为常用的方法,而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好。 问:哪种转染试剂效果好? …
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