通过alamarBlue 法分析细胞活力

水溶性染料 alamarBlue 已用于体外定量多种类型细胞的活力( Fields and Lancaster 1993; Ahmed et al. 1994 ) 。该试剂极其稳定且无毒，因此可用于长时间连续监测细胞( Ahmed et al. 1994 ) 。基于上述原因， alamarBlue法被认为优于MTT 检测等经典的细胞活力检测方法。在一个比较实验中， 用117种不同的毒性分子分别处理细胞， 对于大多数化合物， alamarBlue 法比MTT 法略为灵敏( Hamid et al. 2004 ) 。

下列方案介绍了对培养于96 孔组织培养板的细胞进行活力检测。该检测方法可做改动以适应更大的培养板； 但是对于初步分析转染试剂和转染方案参数对细胞活力的影响， 96孔板形式是最节约成本的。

试剂

alamarBlue

已转染的哺乳动物细胞

SDS (3% ，可选；见步骤5 )

设备

具读板功能的荧光计

96 孔板， 标准平底

96 孔板， 经组织培养处理

方法

1. 在96 孔板中每孔接种50 ~ 50 000 细胞。每组条件做3 个重复。

做一个未处理细胞和一个无细胞的对照孔。此外， 如需要， 可做含转染试剂但无细胞的孔和细胞毒性的阳性对照孔。

通常在经历基因毒性刺激后进行细胞活力检测。根据实验需要，毒性试剂可在检测过程中保留在细胞培养基内或在检测前除去。会干扰线粒体功能的毒性试剂可能产生误导性的结果，因为许多刃天青还原反应发生在线粒体内。

2. 测量孔内培养基的体积，加入0.1 倍体积的alamarBlue 。

细胞培养基中存在pH 指示剂酚红不会干扰检测。

3. 在37°C 组织培养孵箱中培养1 ~ 4h 。

因细胞系的代谢能力和与染料的孵育时间长度不同，不同类型的细胞将刃天青还原为试卤灵的能力有差异。对多数应用来说1 ~4h 的孵育已足够。尽管5000~ 50 000 个细胞孵育lh 即可，但较少的50 ~ 5000 个细胞可能需要24h 的长时间孵育。对于筛选试验的优化，需通过实验来确定每孔细胞数和孵育时间长度。

4 . 将l00μL 细胞培养上清转移至平底96 孔板， 继续进行步骤5 或步骤6 。

5 . 如果不马上进行读数，每l00μL 初始培养体积中加入50μL 3% SDS 来终止和稳定反应。如将培养板避光并加盖防止蒸发， 可在室温下保存达24h 再继续下一步。

6. 在560nm 激发波长、590nm 发射波长下读板。如果使用固定波长的读板仪，可用的激发波长范围是540~570nm, 发射波长范围是580 ~ 610nm 。

如果读数超过荧光仪的检测限度，用细胞培养基或PBS 将悬液稀释10 ~ 100 倍， 然后重复测量。

alamarBlue 检测还可用分光光度计测量570nm 的吸光度，以600 nm 读数作为参比。然而，荧光检测比吸光度检测灵敏得多。

7. 从每个读数中减去空白值（ 即无细胞孔） ，用校正值作图。读数与代谢活性和细胞活力成正比。