2025年 2 月 19日, 星期三
新闻

细胞生物学

我自己订的shRNA的质粒,不管是瞬转还是稳转,转录水平敲下来了百分之90了,但是蛋白水平就是不变😰。48小时、96小时、120小时我都收过,都是这样。我该怎么办呢?

根据描述,您的shRNA已经成功将转录水平(mRNA水平)敲低了90%,但蛋白水平却没有显著变化。这种情况在RNA干扰实验中并不罕见,可能由以下原因导致: 可能原因分析 蛋白半衰期较长: 有些蛋白具有较长的半衰期,即使mRNA水平显著下降,蛋白水平可能仍然稳定。这是因为已有的蛋白质分子不会立即降解,需要更长时间才能逐渐减少。 翻译后调控: 某些蛋白质可能受翻 …

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RNA转染影响因素

1.转染试剂 转染中要额外注意的就是转染试剂应该是确认无RNase污染的,而且也尽量避免和质粒DNA转染混用—即使试剂本身兼容DNA和RNA转染,因RNA与DNA大小不同,转染条件不同,所需的试剂也应不同,所以RNA专用的转染试剂会更好一些。比如Entranster试剂. 2.RNA转染时RNA的用量 RNA转染的用量必须参考RNA转染试剂说明,因为RNA和 …

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已经把miRNA转染到了SW480细胞中,用来抑制RUNX1的表达,从而抑制细胞行为。已经通过WB验证了转染三天后RUNX1受到了抑制。现在的问题是应该在转染三天后消化细胞再做划痕实验,还是先种板做划痕再进行转染。

我的建议: 通常来说,如果你想研究miRNA对划痕愈合(细胞迁移)的影响,建议先进行miRNA转染,等待足够的时间让miRNA发挥作用(你提到的是三天),然后再进行划痕实验。这可以确保在进行划痕实验时,RUNX1已经被下调,迁移实验所观察到的结果是由RUNX1抑制所导致的。 但如果你担心转染后细胞的粘附性不好或者转染效率不高,也可以先进行划痕实验,让细胞在板 …

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细胞转染实验的不同方法

1.DEAE-葡聚糖。这是早在1965年出现的转染方法。带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体可以结合带负电的DNA分子,使得DNA复合物结合在带负电的细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克,也可能是细胞内吞作用使得DNA复合体进入细胞。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染,可重复性好,转染时要除掉血清。 2.磷酸钙共沉淀转染。最早在1973年 …

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电转染实验时,siRNA有什么要求?

      使用Entranster-E试剂进行电转染实验时,要求使用纯度高、无菌且序列正确的siRNA。确定电转染的最佳siRNA浓度。尝试在250-750nM最终浓度范围内的siRNA浓度。Engreen建议导入一个非靶向或无意义的siRNA控制序列,以验证siRNA的基因特异性。此外,针对具有多个siRNA序列的基因可确保产生的表型不是由于脱靶效应所致 …

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如何做好细胞转染实验?

1.选择合适的转染试剂       不同细胞系转染效率通常不同,但细胞系的选择通常是根据实验的需要,因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献,通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然,最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。如英格恩的 …

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荧光表达的细胞在冻存后72小时后再测荧光情况,可以吗?

荧光表达后的细胞可以在冻存后72小时再测荧光,但有几点需要注意: 细胞存活率:冻存和解冻过程可能会影响细胞的存活率和状态。确保细胞在解冻后恢复良好,具有正常的形态和活力。 荧光稳定性:荧光蛋白的稳定性可能会随时间或细胞状态的变化而有所改变。确保荧光信号在解冻后仍然足够强且稳定。 冻存条件:使用适当的冻存保护剂(如DMSO)并在-80°C或液氮中冻存,以尽量减 …

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做好siRNA转染的要点

1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致siRNA转染实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮 …

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细胞被污染了怎么办?

培养细胞一经污染,多数较难处理。如果污染细胞价值不大,宜弃之;在寻找原因后彻底消毒操作室,复苏或重新购置细胞,再培养。 若污染细胞价值较大,又难于重新得到,可采取以下办法清除。 一、细菌和真菌的清除   1、使用抗生素   抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素,污染后清除用药需采用大于常用量5 …

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RNA转染实验效率低的原因

RNA转染效率低,可能的原因: 1. 转染试剂不适合。建议选择RNA专用转染试剂,如Entranster。 2. 转染试剂和RNA的量不够,或者比例不对。优化实验条件,调整试剂和RNA用量,优化二者比例。 3.检测时间有问题。适当调整检测时间。 4. RNA质量问题。选择纯度高的RNA。 5. 细胞状态不佳。调整细胞状态,调整细胞融合度。

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