2024年 3月 29日, 星期五
新闻

细胞生物学

siRNA转染常见问题及解决方案

1. RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记,决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件,建议先进行预实验优化。 RNA浓度和转染试剂量的优化(24well) 1 2 3 4 RNA工作浓度 25nM 50nM 100nM 150nM 每孔RNA的量(pmol) 0.17μg(12.5pmol) 0.33μ …

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细胞转染实验的关键点

1.细胞密度   一般来说,当细胞密度达到60%~80%时进行转染可以取得较高的转染效率,过低或过高都会影响转染效果。 2.细胞状态   这点非常关键,很多时候传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此,为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性,应尽量使用适度传代的细胞系,并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。   还有,尽量选择无 …

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如何上调或下调特定的miRNA?

miRNA通过与转录本的相互作用,关闭或抑制基因的表达。最近的研究表明它们影响了约三成的基因。miRNA在多个组织中差异表达,这就让表达图谱分析成为研究的重点。同时,miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。 然而,Peng Jin(埃默里大学) 我们使用RNA oligo和载体的方法。对于RNA oligo方法,我们采用类似siRNA双链的miRN …

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小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤

小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤: 1、  于无菌条件下切取鼠头并以75%酒精浸泡1min,解剖出完整鼠脑; 2、  预冷解剖液中分离去除软膜、血管、取大脑皮质漂洗,用眼科剪将皮质反复剪切成碎块; 3、  移入培养皿中,吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2m1,37℃培养箱中消化30min; 4、&nb …

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电转染实验的建议

关于细胞的电转染实验,现提出以下几点建议供大家参考: 1.   选择合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2.   选择合适的细胞 用于 …

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视神经星状胶质细胞的培养

随着细胞培养技术的不断改进,虽然正常细胞难于培养成活,科研人员还是不断研究各种正常细胞的培养方法。到目前为止,几乎体内各种组织细胞均可在体外成功培养。越来越多的研究工作可应用体外培养的正常细胞作为模型开展工作。神经胶质细胞的成功培养最早由Raff 等完成。视神经胶质细胞的培养开始于1990 年,先后有多个实验室培养成功。视神经胶质细胞参与眼部多种疾病的发生、 …

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体外培养细胞的一般性质(二)

体外培养细胞的功能表达(分化) 由于体外细胞培养的过程是不断选择具有分裂增殖能力细胞群的过程,所以细胞群一直处于变化中。体外的细胞培养物逐渐会变为处于动态平衡的由多能干细胞、未分化的定向前体细胞和成熟细胞组成的细胞群体,并且,这种平衡可随着环境条件变化而改变。在细胞密度较低的情况下,连续传代可促进细胞增殖、限制细胞分化,而高细胞密度、低血清和合适的激素条件, …

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siRNA细胞转染操作步骤

下面以Entranster-R4000试剂为例,说一下siRNA转染步骤(24孔板) 1.提前1天细胞种植 贴壁细胞:提前一天将细胞种植在24孔板中,以转染时细胞汇合度(Confluence)在30%左右为宜,转染前全培养基总量为0.45ml。 悬浮细胞:采用对数生长期的细胞,数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105,那 …

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RNA细胞转染过程注意事项

1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过 …

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兔胸主动脉平滑肌细胞的原代培养

由于心血管系统发病率、病死率高,严重威胁人类生命,随着心血管疾病研究的不断深入,以体外培养的血管平滑肌细胞作为研究模型,在心血管疾病,特别是在动脉粥样硬化研究中的应用越来越广泛。 (一)材料与设备 1. 设备超净工作台、离心机、水浴锅、CO2 培养箱、-70 ℃ 冰箱,-20 °C:冰箱。2. 无菌材料培养皿、止血钳、15ml 离心管、刻度吸管、弯头吸管、T …

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