英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
本方案(Chomczynski1993) 可以从部分组织或细胞中同时提取RNA 、DNA 和蛋白质。像它的前身(Chomczynski and Sacchi 1987) 一样，此方法涉及用异硫氰酸胍和苯酚的单相溶液裂解细胞。加入氯仿产生第二（有机）相，从而DNA 和蛋白质被抽提，而RNA留在水相上清中。有机相中DNA 和蛋白质的分离，通过按顺序用乙醇、异丙醇 …
阅读更多 »PCR 标记DNA
PCR 是通过热稳定酶，在模板、dNTPs 和一组与片段3′ 序列互补的引物存在下，对插入物进行次序扩增(Saiki et al. 1988) 。PCR 技术提供的另一优势是在对插入片段的扩增中掺入修正的核苷酸，因此可以生产出不含载体的标记的探针，这排除了在其他方法如缺口翻译所导致的对载体序列的非特异性标记。 目前已有掺入生物素化核苷酸的方法(L …
阅读更多 »如何评估Real-time qPCR定量检测？
一、Real-time qPCR定量方法 可以分为绝对定量和相对定量。 绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA。 相对定量可以分为比较Ct法和其他一些相对方法。比较Ct指的是通过与内参基因Ct值 …
阅读更多 »早期游泳对Shank3基因敲除的自闭症大鼠模型的行为和纹状体转录组的影响
自闭症谱系障碍（ASD）是一种发育障碍，其特点是在儿童期有社会行为缺陷和刻板行为，至今仍缺乏令人满意的医疗干预。早期游泳干预是一种非侵入性的方法，结合了丰富的环境和运动，已被证明可以改善幼儿的大脑发育和治疗神经发育疾病。 2022年3月31日，Yunchen Meng等人在 Neuropsychiatr Disease and Treatment上在线发表题 …
阅读更多 »基因克隆连接到T载体是不是多此一举？
T载体是TA克隆载体的简称，就是利用载体的T末端和PCR产物的A末段连接而将目的基因克隆到载体中的方法。我们都知道，做基因克隆目的基因连接到载体，使目的基因能够在受体细胞进行稳定遗传。部分朋友是把目的片段先克隆到T载体后再酶切连接目的载体的，有部分朋友就直接将PCR产物酶切连接到能够将目的基因带入受体细胞进行稳定遗传的载体中。那么进行TA克隆到底是不是多此一 …
阅读更多 »shRNA转染后，什么时候做RT-PCR最好?
shRNA转染后，进行RT-PCR的最佳时间取决于多种因素，包括细胞类型、转染效率、shRNA的表达和目标基因的降解速度。一般来说，在转染后的24到72小时内进行RT-PCR是比较常见的时间点。具体来说： 24小时后：在这个时间点，可以开始检测到shRNA的表达以及目标基因的初步下调情况。对于一些高效的shRNA，这个时间点可能已经有显著的基因沉默效果。 4 …
阅读更多 »实时荧光定量PCR实验步骤
1、样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时 …
阅读更多 »细胞转染siRNA后，目标基因的表达反而升高的原因是什么？
siRNA转染后目标基因不降反升的现象可能由多种原因引起，常见的因素包括： siRNA设计不合理： siRNA的靶点选择不佳，未能有效靶向目标基因的mRNA，导致抑制效果差或反而激活了基因表达。可以尝试设计不同的siRNA靶点或使用更为优化的siRNA工具进行设计。 转染效率问题： 低转染效率可能导致siRNA无法进入足够多的细胞，从而未能有效抑制目标基因。 …
阅读更多 »质粒被酶切过还可以电转吗？
可以，但得分情况来看： 如果质粒是线性化了（即被酶切成线状DNA）： 可以电转，但是效率明显低于超级螺旋质粒（超螺旋 plasmid，通常是未切割、天然状态下的质粒结构）。 线性质粒在细胞内容易被核酸酶降解，稳定性和转化成功率比超螺旋质粒低很多。 有些时候，比如做基因组编辑（CRISPR knock-in）、整合型表达载体（需要基因组插入时），反而故意使用线 …
阅读更多 »利用CRISPR精确编辑过敏原基因
过敏性疾病是一个持续存在的临床挑战，治疗选择有限。因此，找到一种治疗过敏原的方法、改善过敏性疾病的技术尤为重要。 2022年1月17日，美国INDOOR生物技术公司的研究团队在《Frontiersin Allergy》杂志上发表了一篇题为 New Frontiers: Precise Editing ofAllergen Genes Using CRISPR …
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