英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
因为蛋白质是细胞结构与功能的主要分了成分，因此常常需要测定样品中蛋白质的含量，鉴定混合物中的特殊蛋白质，以及分析蛋白质的组成和序列。此外，蛋白质分析对合成用于诱导抗体生成的多肽，设计供克隆用的寡核苷酸探针以及证实序列数据的正确性是十分必要的。 为确保蛋白质通过电泳技术获得最好的分离，首先有必要估计待测样品中蛋白质的浓度。如果不做分析，蛋白质总量不足就可能妨碍 …
阅读更多 »逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
一、原理 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的 …
阅读更多 »PCR （多聚酶链式反应）
PCR 是1985 年由Kary Mulis 在Cetus 公司发明的，是一种体外复制和扩增DNA的方法。 DNA模板首先在高温下变性，当温度降低时，DNA 两侧的寡核苷酸引物与互补序列结合，在DNA聚合酶作用下，随着温度的缓慢提升，引物逐渐延伸，两条引物之间的区域被合成。然后DNA再次变性，引物再次结合，DNA的合成再次进行，这样周而复始，重复20 …
阅读更多 »请问蛋白半衰期30小时，siRNA转染后大约多久收样合适呢？
既然目标蛋白的半衰期是30小时，说明它在细胞中相对稳定，也就是说，蛋白不会很快降解。 在使用siRNA干扰该蛋白的表达时，有几个关键时间点需要考虑： 一般siRNA作用流程： 转染后6–12小时：siRNA开始被细胞利用，mRNA水平开始下降。 24–48小时：mRNA水平通常显著降低（具体情况因靶基因和细胞类型而异）。 48–72小时：蛋白水平逐步下降，尤 …
阅读更多 »DNA的乙醇沉淀
沉淀DNA 样品能达到浓缩的目的，而且沉淀也会去除阻止许多酶反应的残留氯仿。 一、步骤 于最多体积450 μl 的DNA 样品中，加入1/10体积pH4.2的3 mol/L NaAc, 快速颠倒以混匀。 加入2倍体积95%乙醇或无水乙醇，充分混匀。 样品踩于冷环境中沉淀：-20℃ 过夜，或－70℃30 min, 或干冰中5 min 。 使用干冰进行乙醇沉淀 …
阅读更多 »EMSA实验步骤
一、探针的标记 如下设置探针标记的反应体系： （1）待标记探针 (1.75 pmol/μl) ：2μl （2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1μl （3）Nuclease-Free Water ：5μl （4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1μl （5）T4 P …
阅读更多 »反转录定量PCR 分析小RNA
Northern 杂交可以揭示小RNA 的表达水平，同时也可揭示小RNA 的长度，并且是小RNA 验证和定量的标准。然而， Northern 杂交不能用来检测低丰度小RNA, 也不能检测大量的小RNA 种类。相比之下，定量RT-PCR 更加敏感并且可以适用于高通量处理（图1) 。 图1 小RNA 定量RT-PCR 分析流程图。 试剂 mirVana miRN …
阅读更多 »western-blot实验常见问题及解决方案（enlight）
ELISA不得不懂的实验原理
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。 在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体 …
阅读更多 »RNA的提取方法及原理
RNA提取原理 RNA提取时，加氯仿后分三层：水相(含rna,可能还有少量DNA），中间白色薄层（应该是蛋白和DNA），下层有机相（氯仿和蛋白等） 氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DN …
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