未分类

1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。 2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为 …

1）优化条件：质粒不同，所转染的细胞不同及定量的准确性等因素会导致在一些情况下所做的转染不在该优化条件内。这种情况下需要对质粒转染试剂的配比进行优化。另外，可选用更合适的转染试剂，如Entranster试剂。 2）抑制剂：不要在用于制备DNA-转染试剂复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸 …

    悬浮细胞是指细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长，如淋巴细胞。在实验室经常会遇到悬浮细胞的转染，其和贴壁细胞转染还是有很大不同的。     目前大多数实验室用的是脂质体类的转染试剂，脂质体转染是基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞 …

可能的原因和对应的解决方案如下： 1.引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。 2.循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。 3.酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。 4.退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的 pcr 扩增。以 2 ℃为梯度设计梯度 PCR …

1．选择合适的转染试剂       不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然，最适合的是高效、低毒的转染试剂。如Entranster …

1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …

[实验原理] 总RNA，经寡聚(d丁)纤维素亲和层析柱分离出mRNA，以寡聚(d丁)为引物，经反转录合成双链cDNA。先用反转录酶合成第一条cDNA链；经碱降解作用除去RNA模板后用大肠杆菌DNA聚合酶，以第一条链cDNA的3’末端结构为引物合成第二链，最后形成双链cDNA。 [仪器、材料与试剂] (一)仪器和材料 紫外线透射仪、移液枪、琼脂糖凝胶电泳系统 …

小干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成，包括5个磷酸盐，2个核苷和3个悬臂。SiRNA在RNA沉默通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。在实验室中通过RNAi这种方式，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉默，迅速阻断基因活性。 什么样的转染试剂 …

       siRNA转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；可以选择细胞毒性小的非脂质体类的转染试剂，如Entranster试剂，另外，如果siRNA所靶向的基因对于维持细胞生长是非常 …

    我做了很久的WB，最大的一个难点感觉在于样品制备上！蛋白的降解有些时候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全没事~~如果单独做WB的话，感觉以“快速彻底裂解，先变性后保存”的原则比较有效，尽量选择足够强的裂解液，甚至直接给loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分变 …