2024年 5月 18日, 星期六
新闻

细胞生物学

浅析细胞转染效率低下的原因

影响细胞转染效率低下的原因主要有: 1、细胞太少或细胞密度太大 细胞密度对转染效率有一定的影响。不同的转染试剂,要求转染时的最适细胞密度各不相同,即使同一种试剂,也会因不同的细胞类型或应用而异。转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低,乃至表达水平偏低。因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂,最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法,包括适当 …

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G418筛选转染克隆的注意事项

G418作为稳定转染通用的一种筛选方式,在进行筛选前应该要注意几点: 1.    G418的浓度:G418是一种氨基糖苷类似物,它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。因此在筛选过程中G418的浓度将对转染细胞的筛选产生很大的影响。在筛选之前最好进行条件优化确定最佳筛选浓度。尽管文献有报道筛选浓度,最好还是要自己亲自做一下筛选浓度的确定。 2.  …

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siRNA转染常见问题及解决方案

1. RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记,决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件,建议先进行预实验优化。 RNA浓度和转染试剂量的优化(24well) 1 2 3 4 RNA工作浓度 25nM 50nM 100nM 150nM 每孔RNA的量(pmol) 0.17μg(12.5pmol) 0.33μ …

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细胞RNA转染实验的一些建议

1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过 …

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细胞电转染实验的几点建议

1.   电场强度要合适 合适的电场强度对于电转染实验非常重要,电场强度不能过高,过高会增加细胞的死亡率;也不能过低,过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值,实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2.   细胞状态要好 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞(15代以内,传代后2 …

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如何长期维持你的细胞株?

给养  (给予新鲜的培养基) ,细胞生长过程中会消耗培养基中的某些必需因子,必须更换培养基。 分瓶  (传代、细胞数批减少),细胞数量不断增长,超出容器和培养基的负荷。(PS: 培养和传代是同时进行的,很难只进行一个而不进行另一个操作。) 冻存    细胞株都必须分装冻存样品。可以作为备用,防止细胞表型的漂变 …

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siRNA转染实验的关键点

1.纯化siRNA siRNA的浓度和纯度对转染实验非常重要。为得到高纯度的siRNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致siRNA转染实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮 …

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siRNA转染过程中常见问题及解答

1.RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记,决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件,建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调,但未成功转染的细胞却不受影响,这时转染效率和总的细胞数量就很重要,一般细胞数量较少时转 …

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细胞转染为什么不能加血清?

看过很多细胞转染的高手,在做真核细胞转染时,都是在把核酸和转染试剂的混合液加入细胞表面以前,将融合的细胞的含血清的培养液弃去,用无血清培养基清晰后再加入混合物,4-6h后再换含血清的培养基。这是为什么呢?为什么这些转染试剂要求不含血清呢? 传统的转染试剂有一定的细胞毒性,在转染过程由于提高细胞的通透性因而不能在培养基中添加抗生素。如,阳离子脂质体。带正电的脂 …

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