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实时荧光定量PCR为什么倍受青睐?

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一、 实时荧光定量PCR技术是一种新型的科学定量方法,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
 
该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。

二、 目前,荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料

1. TaqMan荧光探针:

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图所示。

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TaqMan 荧光探针工作原理

 

2. SYBR荧光染料:

PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

三、 传统定量方法,如普通PCR、ELISA、等,需要设置内参实现定量检测的目的。实时荧光定量PCR无需内标,实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。Ct值重现性好,且与起始模板的对数存在线性关系。

 

因此,实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确,重现性最好的定量方法,广泛用于基因表达研究、转基因研究,药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

 

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