英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
通常在进行慢病毒感染后，建议遵循以下操作步骤： 感染后观察细胞状态：感染后一般在48-72小时内可以看到较为明显的表达，但是否开始筛选需要看细胞的状态和感染效率。如果细胞长满了，可以考虑先进行传代，以避免细胞过度拥挤影响生长和感染效果。 喷霉素筛选的时机：喷霉素通常在感染后48-72小时开始筛选，但实际开始筛选的时间取决于感染效率和细胞状态。如果细胞感染后状 …
阅读更多 »RNA沉淀方法
乙醇沉淀RNA通常RNA 可以像DNA 一样沉淀。步骤1. 加入1/10 体积1 mol/L 的NaOAc (pH4. 8) 和2.5 倍体积冷的95 ％的乙醇。2.-20 ℃ 下沉淀过夜。3. 用70 ％的乙醇洗涤沉淀。注意：当你处理少量RNA 的时候（低于5 μg) ，在RNA 沉淀之前加入一些载体或者共沉淀物，这类物质将帮助沉淀RNA, 更容易看见沉淀 …
阅读更多 »原位PCR原理与操作步骤
原位PCR 在科学研究中，每一项新技术的创立都会带来一系列新的研究成果问世，从而推动着各学科的发展。纵观形态研究领域，50年代电子显微镜引入形态学观察领域，带来了从细胞水平到亚细胞水平的深入研究；60-70年代，免疫组织化学与免疫细胞化学技术的广泛应用，又将观察的水平由亚细胞结构推向了蛋白质分子水平，使细胞内众多的活性物质得以进行细胞或亚细胞水平的定位，对医 …
阅读更多 »PCR实验步骤及常见问题汇总
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。 一、 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR) PCR由变性–退火–延伸三个基本反应步骤构成： ① …
阅读更多 »丁醇抽提法浓缩核酸
用仲丁醇（ 2 －丁醇）或正丁醇（ 1 － 丁醇）等溶剂萃取水溶液时，部分水分子会进入有机相，而核酸依然留在水相。重复抽提几次后可显著减少核酸溶液的体积。这一浓缩方法可用于减少稀溶液的体积，以使核酸易于通过乙醇沉淀得到回收。 试剂 DNA 样品 异丁醇 方法 计算核酸溶液体积，在2 5 °C 下加入等量的异丙醇。轻微、充分混匀两相。 加入过多的异丙醇 …
阅读更多 »mRNA的分离纯化原理
【实验原理】 真核生物的mRNA分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1×10-5g RNA，理论上认为每克细胞可分离出5～10mg RNA。其中rRNA为75％～ 85％，tRNA占1 …
阅读更多 »如何将胶内物质转移到膜上？
凝胶是厚而易碎的基质，这使得操作与温浴都很困难。如果要对胶内的内容物进行杂交，必须将内容物从凝胶引导到硝酸纤维素膜或者尼龙膜上。这一过程称为转移。 转移之后，滤膜与一个探针温浴，观察探针是否能与滤膜上的分子杂交。探针由放射性元素或者其他指示剂标记，所以可以被检测。滤膜与探针的杂交称为印迹。 第一次使用印迹技术是由Southern 描述的， 因此， 这种印迹被 …
阅读更多 »无菌操作的注意事项及常见问题
做不同的实验，操作上会有小小的不同，而且不可能每个动作都被描述，所以实验时必须注意自己的动作。通常要注意的就是每项操作时都要尽可能减少污染的可能性，所以动作要尽量减少。 距离，尽量将所需要的物品放在离手最近的地方。距离越近，移动就越少。 暴露，在空气中移动物品的时间越长，接触空气中微粒的概率则越大。试剂瓶敞口在空气中的时间越长，掉落进去的空气中的微粒越多。灼 …
阅读更多 »构建小RNA 高通量测序文库
小RNA 克隆和高通量测序的结合是纯化和鉴别细胞或组织中小RNA 的有效先进技术。本方案描述了用于Illumina Genome Analyzer 高通量分析的19 ~ 29 个核苷酸小RNA 的克隆方法，通过聚丙烯酰胺凝胶从总RNA 样品中分离纯化小RNA, 并进行两步连接反应：小RNA3′ 端与5′ 腺苷酸DNA 连接物的连接；以 …
阅读更多 »DNA 样品的酚抽提
酚抽提通常用来对DNA 或RNA 样品进行蛋白质的去除。酚与水不互溶，当它们混合时会形成两相，水相和酚相。当含有DNA 的水溶液与酚混合时，蛋白质会进入酚相，再将含DNA 的水相取出进行再抽提和乙醇沉淀浓缩。 一、材料 抗有机溶剂的塑料管，尝试尽可能小的体积，大多数的抽提可以在微量离心管中进行。 TE 饱和的酚：氯仿：异戊醇(25 : 24:1) 氯仿：异戊 …
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