英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
RNA 降解是非常严重的问题，在RNA提取过程中，为防止降解我们需要遵守以下4点基本规则：基本规则1. 把所有接触RNA 的塑料制品以及玻璃制品都高压灭菌。 2. 用于RNA 缓冲液的所有水都要经DEPC 处理。加DEPC 到终浓度0.1% ，再室温放放置过夜，或者灭菌15 min 。DEPC 不能用于Tris 缓冲液，因为DEPC 将会降解成乙醇和二氧化碳 …
阅读更多 »DNA 样品的酚抽提
酚抽提通常用来对DNA 或RNA 样品进行蛋白质的去除。酚与水不互溶，当它们混合时会形成两相，水相和酚相。当含有DNA 的水溶液与酚混合时，蛋白质会进入酚相，再将含DNA 的水相取出进行再抽提和乙醇沉淀浓缩。 一、材料 抗有机溶剂的塑料管，尝试尽可能小的体积，大多数的抽提可以在微量离心管中进行。 TE 饱和的酚：氯仿：异戊醇(25 : 24:1) 氯仿：异戊 …
阅读更多 »cDNA文库构建分为哪些阶段？
cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。cDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以第一条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。 cDNA文库的构建 …
阅读更多 »大肠杆菌转化实验（热击法）
大肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。 1原理： 质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。 2器材： 旋 …
阅读更多 »转子的类型及用途
转子主要有4 种类型：角式、外摆式、连续流式以及区带式。只有角式与外摆式转子是标准的实验室仪器，另外两种只用作专门用途。 角式转子 用途：样品浓缩。实验室中的“苦力” 。 说明：样品沿着与旋转平面成一定角度的方向离心。 优点：离心见效最快。物质具有更高的相对离心力，比在外摆式转子中沉降快。机器的活动组件少，损坏机会小。 缺点：物质被驱向离心管的管壁方向，然后 …
阅读更多 »什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验？
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一 …
阅读更多 »AFLP原理和操作步骤
AFLP是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。本AFLP 技术主要特点 ：分析所需 DNA 量少，仅需 0.5g；可重复性好；多态性强；分辨率高；不需要 Southern 杂交；样品适用性广；稳定的遗传性。在技术特点上，AFLP 实际上是 RAPD 和 RFLP 相结合的一种产物。它既克服了 RFLP 技术复杂、有放射性危 …
阅读更多 »原位PCR原理与操作步骤
原位PCR 在科学研究中，每一项新技术的创立都会带来一系列新的研究成果问世，从而推动着各学科的发展。纵观形态研究领域，50年代电子显微镜引入形态学观察领域，带来了从细胞水平到亚细胞水平的深入研究；60-70年代，免疫组织化学与免疫细胞化学技术的广泛应用，又将观察的水平由亚细胞结构推向了蛋白质分子水平，使细胞内众多的活性物质得以进行细胞或亚细胞水平的定位，对医 …
阅读更多 »PCR扩增产物出现杂带怎么办？
可能的原因和对应的解决方案如下： 1.引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。 2.循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。 3.酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。 4.退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的 pcr 扩增。以 2 度为梯度设计梯度 PCR …
阅读更多 »ChIP超详细实验步骤
ChIP的一般流程： 甲醛处理细胞—收集细胞，超声破碎—加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合—加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀—对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合—洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物—解交联，纯化富集的DNA-片断 …
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