英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
1.DEAE-葡聚糖。这是早在1965年出现的转染方法。带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体可以结合带负电的DNA分子，使得DNA复合物结合在带负电的细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克，也可能是细胞内吞作用使得DNA复合体进入细胞。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染，可重复性好，转染时要除掉血清。 2.磷酸钙共沉淀转染。最早在1973年 …
阅读更多 »RNA转染效率低的原因是什么？
RNA转染效率低，可能的原因： · 转染试剂不适合。建议选择RNA专用转染试剂，如Entranster试剂。 · 转染试剂和RNA的量不够，或者比例不对。优化实验条件，调整试剂和RNA用量，优化二者比例。 · 检测时间有问题。适当调整检测时间。 · RNA质量问题。选择纯度高的RNA。 · 细胞状态不佳。调整细胞状态，调整细胞融合度。
阅读更多 »siRNA转染效率低的原因有哪些？
1. RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。 2. 细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这 …
阅读更多 »小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤
小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤： 1、 于无菌条件下切取鼠头并以75%酒精浸泡1min，解剖出完整鼠脑； 2、 预冷解剖液中分离去除软膜、血管、取大脑皮质漂洗，用眼科剪将皮质反复剪切成碎块； 3、 移入培养皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2m1，37℃培养箱中消化30min； 4、&nb …
阅读更多 »体外培养细胞的一般性质（三）
体外培养细胞的能量代谢 体外培养细胞的主要能量来自葡萄糖。大多数培养液含1 g/L (5.55mmol/L)葡萄糖， 近年来含4.5g/L 葡萄糖的高糖培养液（主要是DMEM 和RPMil640 ) 使用得越来越多。这使得细胞增殖更快。葡萄糖主要被细胞用作糖酵解的碳源，以乳酸为终产物。培养细胞中三狻酸循环（也称拧檬酸循环）仍然活跃，氨基酸作为碳源，特别是谷氨 …
阅读更多 »RNA细胞转染过程注意事项
1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …
阅读更多 »lonza电转仪可以用于藻类吗
Lonza 电转仪（如 Lonza 的 Nucleofector 系列）主要设计用于动物细胞和一些较为脆弱的细胞类型，比如哺乳动物细胞、原代细胞、干细胞等。这类电转仪器的主要特点是通过特定的低压和特定波形脉冲，能在不损伤细胞的情况下实现较高的转染效率。因此，Lonza 电转仪并不是专门为藻类细胞设计的，使用时可能会遇到一些问题和限制。 使用 Lonza 电转 …
阅读更多 »影响RNA转染的因素
转染试剂 转染中要额外注意的就是转染试剂应该是确认无RNase污染的，而且也尽量避免和质粒DNA转染混用——即使试剂本身兼容DNA和RNA转染，因RNA与DNA大小不同，转染条件不同，所需的试剂也应不同，所以RNA专用的转染试剂会更好一些。比如Entranster-R4000. RNA转染时RNA的用量 RNA转染的用量必须参考RNA转染试剂说明，因为RNA …
阅读更多 »怎样提高细胞转染效率？
1．选择合适的转染试剂 不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然，最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。如英格恩的 …
阅读更多 »两个shRNA在转录水平和蛋白水平都有效抑制了基因表达，但是表型做出来却不一致，是为什么？
这种情况可能是由多种因素引起的，以下是一些可能的原因： 转录水平和蛋白水平的不同调控机制：虽然shRNA能够有效地降低目标基因的mRNA和蛋白表达，但有时候蛋白质的功能并不完全依赖于其表达量。有可能是基因表达抑制后，细胞通过一些补偿机制（比如其他途径的上调或活化）来恢复其功能，导致表型不一致。 shRNA的特异性和脱靶效应：shRNA可能会靶向与目标基因相似 …
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