英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
我认为，要想做好质粒DNA细胞转染实验，应注意以下几点： 1， 质粒的大小和质量 线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。而线性化DNA转染的整合几率高。质粒太大了转染会困难一些。毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。如果你的质粒正好比较大，又没有经验，选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几 …
阅读更多 »电转染过程中易出现的问题
1. 不合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度 2. 细胞选择错误 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构 …
阅读更多 »如何优化细胞RNA转染实验条件？
可从以下几方面进行优化： 1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如 …
阅读更多 »siRNA转染后什么时候做qRT-PCR检测最好？
1.siRNA转染后什么时候做qRT-PCR检测最好？ siRNA的沉默效果是有时效性的，在最佳的时间点观察，会得到更加明显的沉默效果，这个时间点的确定不能以同一株细胞转染DNA的经验确定，因为一个是消耗mRNA，一个是产生mRNA。对转染siRNA，在核酸水平，转染后8-48小时，即可观察到mRNA水平的逐步下降，一般来说，转染后48小时进行qRT-PCR …
阅读更多 »siRNA细胞转染操作步骤
下面以Entranster-R4000试剂为例，说一下siRNA转染步骤（24孔板） 1.提前1天细胞种植 贴壁细胞：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30％左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那 …
阅读更多 »电转染试剂（Entranster-E）转染Huh7细胞效果图
怎样做好细胞电转染实验？
要想做好细胞的电转染实验，应注意以下几点： 1. 选择合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 选择合适的细胞 用于电转的细胞 …
阅读更多 »如何上调或下调特定的miRNA？
miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达。最近的研究表明它们影响了约三成的基因。miRNA在多个组织中差异表达，这就让表达图谱分析成为研究的重点。同时，miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。 然而，Peng Jin(埃默里大学) 我们使用RNA oligo和载体的方法。对于RNA oligo方法，我们采用类似siRNA双链的miRN …
阅读更多 »siRNA答疑专题总结（上）
Q1：如果慢病毒载体中没有抗性标记，只有GFP，请问还能筛选稳转的细胞传代培养吗？ A1：采用流式分选是流式细胞仪的一个功能，有流式细胞仪就可以了。一般实验室对流式都有专门的人员操作，不需要自己动手。由于没有抗性，需要注意分选过程的无菌操作。 Q2：RNA干扰如果用慢病毒做稳转的细胞株，什么样的目的RNA都可以用来干扰来做稳转的细胞株吗，目的RNA所编码蛋白 …
阅读更多 »为什么我的细胞电转染实验做不好？
要想做好细胞的电转染实验，应注意以下几点： 1. 选择合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 选择合适的细胞 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内 …
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