英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
可能有多种原因： 目标蛋白对细胞有毒性，导致细胞死亡； 转染试剂以及DNA用量信息需要优化，否则对细胞具有伤害； 细胞贴壁转染之后没有正常换液。 建议： 考虑对目标蛋白进行截短构建、尝试其他细胞系统； 摸索转染试剂以及DNA用量信息，如果转染试剂毒性太大，可以考虑尝试Entranster转染试剂。 对转染后的细胞进行换液处理，如果细胞状态感觉不够理想，可以考 …
阅读更多 »DEAE－葡聚糖介导的转染：高效率的转染方法
DEAE －葡聚糖介导的转染与磷酸钙共沉淀介导的转染在三个方面有重要的不同。第一，该方法用于克隆基因的瞬时表达，而不是细胞的稳定转化(Gluzman 1981 ) 。第二，该方法对BSC-1 、CV- 1 和COS 等细胞系非常有效，但对许多其他类型的细胞转染效果不理想。第三， DEAE－葡聚糖转染的DNA 用量比磷酸钙共沉淀转染少。采用0.1 ~ 1.0μ …
阅读更多 »做好RNA转染的几点建议
1.纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过 …
阅读更多 »悬浮细胞的siRNA转染实验步骤
悬浮细胞的siRNA转染操作步骤，以24孔板siRNA转染为例 1.提前1天细胞种植 悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×105，那么就用2×105的细胞进行转染。 2.转染过程 ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μ …
阅读更多 »为什么脂质体细胞转染试剂会造成细胞毒性？
已有众多的文献报道，脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的上调或下调。如参与PKC（蛋白激酶C）通路调节(Biochemistry.1992 Sep 22;31(37): 9025-30)；如抑制ATP酶的活性(Biochim Biophys Acta.2008 Apr;1777 …
阅读更多 »电转效率受哪些因素影响？
电穿孔效率受以下几种因素的影响： 外加电场的强度。电压过低，培养细胞质膜的改变不足以允许DNA 通过； 电压过高，细胞会受到不可逆的损伤。对于大多数哺乳动物细胞系， 电压250~ 500V/cm时可达到最高瞬时表达水平。通常经过电穿孔， 20% ～ 50％的细胞能够存活（根据台盼蓝拒染法的检测结果） ( Patterson 1979; Baum et al. …
阅读更多 »细胞转染实验的关键点
1.细胞密度 一般来说，当细胞密度达到60%～80%时进行转染可以取得较高的转染效率，过低或过高都会影响转染效果。 2.细胞状态 这点非常关键，很多时候传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此，为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性，应尽量使用适度传代的细胞系，并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。 还有，尽量选择无 …
阅读更多 »流式检测细胞周期操作步骤
流式检测细胞周期操作步骤 1. 细胞培养： 取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。 2. 细胞固定： 800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。 3. 细胞染色： 1 …
阅读更多 »电穿孔和电融合技术原理及流程
[实验原理] 当细胞置于非常高的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分子扩散进细胞内，这一现象称为电穿孔。运用这一技术，许多物质，包括DNA、RNA、蛋白质、药物、抗体和荧光探针都能载入细胞。作为一种基因转导方法，电穿孔已被广泛用于各种细胞类型，包括细菌、酵母、植物和动物细胞；而且，它还能作为注射方法（称为电注射），把各种外源物质引入活细胞。与其他常用 …
阅读更多 »如何解决病毒感染细胞效率低的难题？
病毒感染细胞本来效率就较低，一定要注意以下几点：1.感染时的培养基尽量少些；2. 每1ml的培养基中加入5-10ul的Polybrene（储存液浓度为2mg/ml ），可以提高效率约3-5倍。不过病毒感染效率的问题都是相对的，达到自己的研究目的即可。 病毒感染 …
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