细胞转染

       siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说化学转染技术（Entranster）是最为常用的方法，而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好 …

基因重组是由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。基因重组的目的是使目的基因的某一细胞中能得到高效表达，即产生人们说需要的高产目的的基因产物，如蛋白质、多肽内生物药物。 基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下有转译出相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出 …

问题1：“感染两天，puro杀3天，5天细胞都长很密” 原因： 细胞分裂快（比如 293T）→ 在5天内即使有筛选，还是会长满。 感染率高 → 很多细胞表达抗性，嘌呤霉素筛选不够“稀释” 建议： 缩短时间：感染 24h 后就加 puromycin，第 2 天开始杀，杀 2–3 天就足够。 更稀释的病毒梯度：推荐加大稀释倍数：1:1000，1:5000，甚至 …

       对于难转染的细胞的转染，如何提高转染效率的问题也是目前研究的技术难题。一般建议使用电转的方法，但是由于电转的方法对细胞损伤比较大，该方法也未必是最佳的。推荐Entranster-E电转染试剂，可将电击对细胞的损伤降到最低。转染效率的确定，常用的是流式细胞仪检测的方法。

细胞电转染实验效率低的原因一般有以下几点： 1. 不合适的电场强度 合适的电场强度对于电转染实验非常重要，电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，实验前应测定所转染细胞系的最佳电场强度。 2. 细胞选择错误 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d …

        血清中含有大量的蛋白质，在转染过程中，带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体对核酸的吸附，影响转染效率。另外，使用脂质体等转染试剂时，由于含血清转染会将血清中的蛋白带入细胞，引发细胞毒性，导致转染效率降低，故不能有血清转染。这些转染试剂要求在转染前换无血清培养基，转染后4-6h在更换成有 …

已有众多的文献报道，脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的上调或下调。如参与PKC（蛋白激酶C）通路调节(Biochemistry.1992 Sep 22;31(37): 9025-30)；如抑制ATP酶的活性(Biochim Biophys Acta.2008 Apr;1777(4):362-8)；如与线粒体膜发生作用(J Biol Chem. 19 …

     悬浮细胞是指细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长，如淋巴细胞。在实验室经常会遇到悬浮细胞的转染，其和贴壁细胞转染还是有很大不同的。     目前大多数实验室用的是脂质体类的转染试剂，脂质体转染是基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内，而脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会 …

影响细胞转染效率低下的原因主要有： 1、细胞太少或细胞密度太大 细胞密度对转染效率有一定的影响。不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂，最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法，包括适当 …

1 电场参数 电场是电转染的重要因素，细胞在电场的作用下，膜通透性增加或是形成小孔，以完成转染过程。因此电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此，一个适宜的电场强度至关重要。 不同细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外，还可以 …