英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
在单克隆抗体的特异性得到充分验证之前，应该对所有候选的杂交瘤进行建系。但为了减少不必要的工作量，可以选择其中20 个最佳的候选孔。在检测这20 个孔的培养上清为阳性后，应该将这些孔的细胞进行冻存，同时进行有限稀释。 附加材料 生长的杂交瘤 克隆和扩增用培养基 24 孔板 4ml 有盖试管，无菌 步骤 当96 孔板中生长的杂交瘤长到2 5%~50 ％汇合时（主 …
阅读更多 »什么是反向PCR？
1、原理 反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究. 2、目 …
阅读更多 »转染实验加药问题，做荧光定量是不是铺板的时候加药24小时后转染，做wb就是转染12小时后加药呢？
答：你描述的策略（铺板加药做qPCR，转染后加药做WB）是合理的，并且遵循了两种检测方法对时间需求的不同逻辑：qPCR关注转录早期/中期，WB关注蛋白积累的中/后期。 这不是唯一方案： qPCR： 有时也可以在转染后某个时间点（如6-12小时）加药，再培养足够时间（如再培养18-36小时）后收样，总处理时间也可能达到24-48小时。这取决于药物起效速度和你想 …
阅读更多 »聚丙烯酰胺凝胶的配制
表1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液 不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml） 溶液成分 5 10 15 20 25 30 40 50 6% 水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30%丙烯酰胺溶液 1 2 3 4 5 6 8 10 1.5 mol/L Tris (pH …
阅读更多 »琼脂糖凝胶电泳拖尾了怎么办？
跑过琼脂糖凝胶电泳的小伙伴，是不是经常遇到过电泳拖尾的现象啊？相信不少人点头如捣蒜了。提个质粒拖尾，提个DNA拖尾，连PCR也拖尾，拖尾什么的最常见了。验证也就算了，关键是图片拍出来不好看了，发文章什么的太影响档次了。下面我就跟据自己的经验跟大家讲讲琼脂糖凝胶电泳为什么会拖尾，有不足的希望大家多多评论补足啊（三人行必有我师嘛）！！ 那琼脂糖凝胶电泳为什么会拖 …
阅读更多 »western-blot化学发光（ECL）为什么会淬灭？
做Western Blot发光实验经常有“淬灭”的情况发生，经常有朋友反映，加发光试剂后立刻可以看到很明显的亮光，可亮光很快就消逝了，压完片后，条带却很弱，甚至什么也没有。这种情况发生的原因是什么？ 要解释这种情况发生的原因，必须先了解ECL化学发光的原理。一般的发光试剂含鲁米诺和H2O2、发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRP和H2O …
阅读更多 »DNA 序列测定——化学(Maxam-Gilbert) 测序法
在Maxam 和Gilbert 发展的DNA 化学测序法(1977, 1980) 中，碱基专一性化学试剂在一种或两种特定核苷酸位置上随机断裂已纯化的3’端或5′ 端标记的DNA, 产生4 套寡聚脱氧核糖核苷酸。因为只有末端标记的DNA 片段才能在测序胶的放射自显影图中显示出来，所以只能观察到含有固定末端的片段，这样就产生了4 列DNA …
阅读更多 »异丙醇法沉淀DNA
DNA 在含有异丙醇的溶液中比在含有乙醇的溶液中难溶。乙醇沉淀法需要2 ~ 3 倍体积的乙醇，异丙醇沉淀则需要0.6 ~ 0.7 倍的体积。沉淀大体积溶液中的DNA 时，异丙醇是比较好的选择。在室温用异丙醇沉淀减少了一些蔗糖或者氯化钠和DNA 发生共沉淀的现象。但异丙醇还是有一些不足之处： 盐在35 ％的异丙醇溶液中比在65 ％的乙醇溶液中难溶。 DNA 沉 …
阅读更多 »如何做好western-blot实验
1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。 2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的 …
阅读更多 »分子实验什么时候需要无菌操作？
什么时候使用无菌技术？ 当必须进行无菌操作时。无论什么时候在进行活的有机体实验或是为进行活体实验而准备培养基、缓冲液、培养容器等时，必须使用无菌操作技术，例如： · 准备转化用的大肠杆菌培养物 · 制备LB 平板培养基 · 分装细胞 · 过滤培养基的血清 · 打开和溶解冻干细菌 在无菌操作有帮助的情况下。如果不想容器或是区域中的物质进入另一个容器或是区域时， …
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