英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
分离后， DNA 经常被用于导入细胞和微生物，用来观察受体菌表型的改变或收获大批的供体DNA 及其翻译产物。 原核细胞 转化是细菌与分离的DNA 重组后发生遗传基因的改变。转化通常用来扩增克隆的DNA, 另一个常见的用途是获得大量特定的蛋白质——转化了表达载体的细菌将产生大量的DNA 编码的蛋白质。细菌转化主要有两种方法。 与高浓度的钙离子温育，导致细菌的脂 …
阅读更多 »磷酸钙转染法实验原理及步骤
【实 验 原 理】 磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。 【仪器、材料和试 …
阅读更多 »PCR-SSCP实验步骤
一．样品制备 1．PCR扩增并检测。根据不同的引物挑选适合的退火温度进行PCR扩增。扩增产物用2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量3-5ul。PCR产物为10ng/nl左右为最佳。 2．PCR产物与变性buffer混合。在干净的PCR管底部加入5ul SSCP上样缓冲液（变性缓冲液），然后在缓冲液中央加入PCR扩增产物。按照经验，扩增效果在琼脂糖胶 …
阅读更多 »WB发光检测中常见的问题及解决方法
免疫印迹试验（Western blot）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。其中较为简单也为大家所普遍接受的Western blot显色方法为底物化学发光法ECL，文章根据发光检测中常见的几种问题现象与各位生物人一起探讨。疫印迹试验（Western blot）是分子生物 …
阅读更多 »western-blot化学发光（ECL）时，胶片上条带很浓怎么办？
可通过以下几个方面进行改进： 1. 可减少蛋白上样量； 2. 降低一抗二抗稀释度，减少抗体孵育时间； 3. 如果背景深的话，则要把发光液沥干些再压片；如果背景不深则需减少发光时间和显影时间。 4.选择合适的发光液，比如Enlight。
阅读更多 »单克隆抗体的制备——杂交瘤的建系
在单克隆抗体的特异性得到充分验证之前，应该对所有候选的杂交瘤进行建系。但为了减少不必要的工作量，可以选择其中20 个最佳的候选孔。在检测这20 个孔的培养上清为阳性后，应该将这些孔的细胞进行冻存，同时进行有限稀释。 附加材料 生长的杂交瘤 克隆和扩增用培养基 24 孔板 4ml 有盖试管，无菌 步骤 当96 孔板中生长的杂交瘤长到2 5%~50 ％汇合时（主 …
阅读更多 »无菌操作的注意事项及常见问题
做不同的实验，操作上会有小小的不同，而且不可能每个动作都被描述，所以实验时必须注意自己的动作。通常要注意的就是每项操作时都要尽可能减少污染的可能性，所以动作要尽量减少。 距离，尽量将所需要的物品放在离手最近的地方。距离越近，移动就越少。 暴露，在空气中移动物品的时间越长，接触空气中微粒的概率则越大。试剂瓶敞口在空气中的时间越长，掉落进去的空气中的微粒越多。灼 …
阅读更多 »western-blot实验过程常见问题
常见问题 …
阅读更多 »降落PCR实验原理及步骤
降落PCR（touchdown PCR），一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。 实验材料: 基因样品 仪器、耗材: PCR仪 实验步骤： 1、反应体积为50 μl。 2、人CD137胞膜外区基因的PCR扩增体系：CD1 …
阅读更多 »问：现在是将构建好的质粒电转入到自制的感受态细胞里，质粒有10000bp，是90μL感受态细胞中加3.5μ质粒。我之前有电转过6000多bp的质粒，过夜培养可以长菌的。但是这个10000bp的质粒过夜培养没有单菌落，延长培养时间后有个别单菌落，但是挑单菌落到LB中并不浑浊。这种情况我是应该调整一下电转程序还是改一下加入质粒的量呢？
以下是详细的优化建议： 优化质粒用量（首要调整）： 问题： 你目前使用的是3.5µL质粒加入90µL感受态细胞。关键在于质粒的浓度（ng/µL），而不是体积。 3.5µL 对于90µL感受态细胞来说体积不小，如果质粒浓度较高，实际DNA量可能大大超过电转最优范围。 原理： 过量的DNA会导致电击时产生过多的热量和离子效应，严重降低转化效率，尤其对大质粒（&g …
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