英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
当细胞被裂解，内容物释放时，蛋白水解酶和其他一些降解的酶也一同被释放，这时候需要在裂解的缓冲液中加入蛋白水解酶。PS: 细胞自己的蛋白水解酶也会降解细胞内的蛋白质。 抑制剂 靶向的蛋白酶 有效浓度 储存浓度 其他 抑蛋白酶肽 丝氨酸蛋白水解酶 0.1-2ug/ml 10mg/ml溶解在PBS中 避免反复冻融 EDTA 金属蛋白水解酶 0.5-2mmol/L …
阅读更多 »小RNA 的Northern 杂交分析
该方案描述如何运用Northern 杂交检测15~150 个核昔酸的小RNA （图1) 。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总RNA, 再采用半干法进行转膜。RNA 通过紫外线照射交联至尼龙膜上，在Church 缓冲液中对RNA 和α-32p标记的寡核昔酸探针进行杂交，并用磷酸成像分析技术(phosphorimager analysis) 进行检测分析。使用包含两个 …
阅读更多 »14-3-3蛋白家族与精神分裂症
精神分裂症是一种使人衰弱的精神障碍，影响着世界上大约1%的人口，但人们对这种疾病并不是十分了解。精神分裂症的遗传学是非常异质的，因此很难确定可能导致这种疾病的具体改变。然而，越来越多来自人类研究的证据表明，14-3-3家族的改变与精神分裂症之间存在联系。 2022年3月14日，发表于Frontuers in Molecular Neuroscience 的一 …
阅读更多 »大肠杆菌电转后，4度涂抹到培养基板子上会导致死亡吗？细菌电转后是不是比细胞还脆弱啊？
这个问题问得很实际，也很关键，特别是在做质粒转化实验的时候容易遇到。 回答一：大肠杆菌电转后，4℃下操作是否会导致死亡？ 不会直接导致大面积死亡，但确实会影响转化效率。 电转后的大肠杆菌处于一种“受伤”的状态，细胞膜被电击短暂打破，虽然迅速恢复，但暂时很脆弱。 如果在电转后没有及时给予复苏（比如在SOC、LB等液体培养基中摇床复苏30–60分钟），就直接在低 …
阅读更多 »western-blot实验成功要点
1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。 2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的 …
阅读更多 »验证shRNA的敲除效率时，qPCR引物怎么才能设计在靶标附近
在用 qPCR验证shRNA敲除效率 时，引物设计是非常关键的一步。你提到要“设计在靶标附近”，这个思路是对的，但还需要进一步明确几个关键点。 理解shRNA的作用机制： shRNA经过加工后变成siRNA，通过RNA干扰机制（RNAi），引导RISC复合体结合并切割目标mRNA。 切割点通常位于shRNA的互补区域中间（即靶序列中心）。 qPCR引物设计的 …
阅读更多 »昼夜节律转录因子BMAL1在生殖内分泌学和生育中的关键作用
脑和肌肉芳烃受体核转位蛋白1（BMAL1）是昼夜节律振荡的核心成分，参与了许多生理活动。越来越多的证据表明BMAL1在生殖生理学中发挥着重要作用。 2022年3月2日，Yin Jiang 等人在Front Endo-crinol（Lausanne）上发表了一篇题为Critical Roles of the Circadian Transcription Fa …
阅读更多 »为什么荧光原位杂交备受关注？
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。 一 …
阅读更多 »western-blot化学发光（ECL）时，胶片上条带很浓怎么办？
可通过以下几个方面进行改进： 1. 可减少蛋白上样量； 2. 降低一抗二抗稀释度，减少抗体孵育时间； 3. 如果背景深的话，则要把发光液沥干些再压片；如果背景不深则需减少发光时间和显影时间。 4.选择合适的发光液，比如Enlight。
阅读更多 »聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项
聚丙烯酰胺凝胶必须由丙烯酰胺单体、聚合起始物、催化剂以及合适的盐及缓冲液的混合物聚合起来。 丙烯酰胺与BIS (N, N’ – 亚甲双丙烯酰胺）是形成胶基质的单体。 过硫酸铵启动胶的聚合过程。胶的配方要求10% 以水配制的过硫酸铵溶液。大多数资料显示需要现配现用。但是，10 ％溶液可以在4℃放置数周而没有明显的活性丢失。最多配制10 …
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