英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
下面程序描述了使用修饰染料核苷酸，用同步DNA 切割通过缺口翻译制备荧光DNA，缺口翻译是通过摸索修饰dUTP 和dTP 的荧光素或花青的最佳条件完成的(Keller 1993; Yu et al. 1994; Zhu et al. 1994) 。该方法对用四甲基罗丹明、德克萨斯红、香豆素和bodipy 修饰的核苷酸可能也适用，但染料的类型、接头、核苷酸以及 …
阅读更多 »动物基因组DNA的提取
实验原理 在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于构建基因组文库和 Southern分析。 通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。 仪器、材料与试剂 (一)仪器 1 . 台式离心机 2 …
阅读更多 »分子克隆中常用的其他酶
一、DNA 聚合酶 分子克隆中的许多步骤都涉及在DNA 聚合酶催化下的DNA 体外合成反应。这些酶作用时大多需要模板，合成产物的序列则与模板互补。大多数聚合酶优先作用于DNA 模板，但也可拷贝RNA ，尽管这时效率较低。最常用的依赖于DNA 的DNA 聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶 I （全酶）、大肠杆菌DNA 聚合酶I 大片段(Klenow 片段）、T4 …
阅读更多 »碱－SDS 质粒小量制备
小量制备可以从细菌培养物中抽提和分析，离心机12 或16 管足够一次制备。 一、材料 5 ml 过夜培养细菌培养物。使用LB培养基加入合适的抗生素培养单克隆菌体，37’C 振荡培养 灭菌的微桩离心管 冰 溶液I （裂解缓冲液， 25 mmol/L Tr的HCI pH8.0, 50 mmol/L葡萄糖， 10 mmol/LEDTA) ，冰上预冷 溶 …
阅读更多 »做慢病毒滴度测定实验，请问是所有的都用293t细胞来做，还是说我要在别的细胞上做稳转株，我用别的细胞去摸病毒滴度就可以呀？
核心原则 标准物理滴度测定：强烈推荐使用293T细胞。 功能性滴度测定/特定应用验证：使用你的目标细胞。 详细解释 为什么推荐293T细胞测定物理滴度？ 高易感性： 293T细胞对慢病毒感染非常敏感，因为它们高表达慢病毒进入所需的受体（如LDL受体）。 高转导效率： 它们通常能达到非常高的转导效率（>80%甚至90%+），这使得检测阳性细胞、计算滴度变 …
阅读更多 »电穿孔和电融合技术原理及流程
[实验原理] 当细胞置于非常高的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分子扩散进细胞内，这一现象称为电穿孔。运用这一技术，许多物质，包括DNA、RNA、蛋白质、药物、抗体和荧光探针都能载入细胞。作为一种基因转导方法，电穿孔已被广泛用于各种细胞类型，包括细菌、酵母、植物和动物细胞；而且，它还能作为注射方法（称为电注射），把各种外源物质引入活细胞。与其他常用 …
阅读更多 »普通PCR的基本原理和注意事项
1、概述 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. K …
阅读更多 »将DNA 导入细胞和微生物
分离后， DNA 经常被用于导入细胞和微生物，用来观察受体菌表型的改变或收获大批的供体DNA 及其翻译产物。 原核细胞 转化是细菌与分离的DNA 重组后发生遗传基因的改变。转化通常用来扩增克隆的DNA, 另一个常见的用途是获得大量特定的蛋白质——转化了表达载体的细菌将产生大量的DNA 编码的蛋白质。细菌转化主要有两种方法。 与高浓度的钙离子温育，导致细菌的脂 …
阅读更多 »在哺乳动物细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA 功能
向哺乳动物细胞内转染反义寡核苷酸从而抑制miRNA 功能的具体方法参照本方案。通过检测miRNA 靶蛋白水平或携带miRNA 靶基因的3’端非翻译区( 3UTR ) 报道基因的活性来检测ASO 对于miRNA 的效应。本方案主要针对24 孔板设计，如果用其他多孔板、细胞瓶或不同直径培养皿培养细胞，需根据孔／瓶表面积计算细胞密度和试剂体积 试剂 A …
阅读更多 »Western-Blot中BSA,脱脂蛋白的作用是什么？
经常有人做Western-Blot会疑惑：为什么做蛋白实验，应该把杂蛋白去除才对，会担心其他蛋白的加入会影响实验结果，增加背景。但为什么偏偏会用加入BSA，脱脂蛋白的方法减少背景呢？ 这需要从Western-Blot的原理说起，Western-Blot中电泳转膜后让蛋白分布NC膜或PVDF膜上，但膜上还有很多地方是空白的，这些空白的地方如果不被封闭，很可能就 …
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