英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
推荐用6 ％丙烯酰胺、非梯度胶为起点。可使用两种胶：一种在相对短的时间获得较短的寡核苷酸信息；另一种是用较长时间以使较长的寡核苷酸得到最大限度的分离。这两种凝胶分离过程，采用6 ％丙烯酰胺，可以从一套测序反应中获得300~350 个碱基的序列信息。另一种可选的方案是使用两种不同浓度的胶，使较短片段和较长片段的寡核苷酸得到最大限度的分离。 材料 盛于喷射洗瓶的 …
阅读更多 »哪些因素会造成western-blot发光时发生荧光“淬灭”？
荧光淬灭是Western Blot发光时常见的现象，即加ECL发光液后立刻可以看到很明显的亮光，但亮光很快就消逝了，压完片后条带却很弱，甚至没有条带，发生这种情况的原因可能有以下几个方面: 1. 抗体浓度太高，局部过多的HRP会快速消耗底物，导致荧光信号过强，条带呈灼烧样。可降低抗体上样量。 2. 抗体浓 …
阅读更多 »抗体标记的步骤
下列步骤描述了使用Cy3作为代表性标记试剂， 用荧光succinimidy l 活性酶标记羊抗体。其他水溶性荧光标记物的使用与此类似(Mujumdar et al. 1993) 抗体分离与纯化 来源于血清，腹水或培养基的抗体，在标记反应开始以前，需纯化以除去蛋白质和其他含有氨基团的分子。在与标记反应混合以前，抗体不应进行强缓冲处理，不然标记混合物会降低，所有 …
阅读更多 »碱－SDS 质粒小量制备
小量制备可以从细菌培养物中抽提和分析，离心机12 或16 管足够一次制备。 一、材料 5 ml 过夜培养细菌培养物。使用LB培养基加入合适的抗生素培养单克隆菌体，37’C 振荡培养 灭菌的微桩离心管 冰 溶液I （裂解缓冲液， 25 mmol/L Tr的HCI pH8.0, 50 mmol/L葡萄糖， 10 mmol/LEDTA) ，冰上预冷 溶 …
阅读更多 »体外转录法制备dsRNA
该方案是简单而且得到广泛应用的、利用PCR 模板制备双链RNA 的体外转录反应。该方法制备的dsRNA 可以用于在某些细胞或者组织中诱发RNA 干扰。 试剂 琼脂糖凝胶( 1 %)复性缓冲液( 10 X)ATP 、CTP 、GTP 、UTP （ 每种100mmol/L )二硫苏糖醇( DTT ) ( 1mol/L)DNA 分子质量标准dNTP 混合液，每种1 …
阅读更多 »western-blot实验常见问题及解决方案（enlight）
如何做好Northern Blot实验？
准备阶段：1.180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。处理DEPC水(2 L)备用。2.用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。 制胶： 1. 称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入 …
阅读更多 »大肠杆菌转化实验（热击法）
大肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。 1原理： 质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。 2器材： 旋 …
阅读更多 »降落PCR实验原理及步骤
降落PCR（touchdown PCR），一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行，例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。 实验材料: 基因样品 仪器、耗材: PCR仪 实验步骤： 1、反应体积为50 μl。 2、人CD137胞膜外区基因的PCR扩增体系：CD1 …
阅读更多 »问：现在是将构建好的质粒电转入到自制的感受态细胞里，质粒有10000bp，是90μL感受态细胞中加3.5μ质粒。我之前有电转过6000多bp的质粒，过夜培养可以长菌的。但是这个10000bp的质粒过夜培养没有单菌落，延长培养时间后有个别单菌落，但是挑单菌落到LB中并不浑浊。这种情况我是应该调整一下电转程序还是改一下加入质粒的量呢？
以下是详细的优化建议： 优化质粒用量（首要调整）： 问题： 你目前使用的是3.5µL质粒加入90µL感受态细胞。关键在于质粒的浓度（ng/µL），而不是体积。 3.5µL 对于90µL感受态细胞来说体积不小，如果质粒浓度较高，实际DNA量可能大大超过电转最优范围。 原理： 过量的DNA会导致电击时产生过多的热量和离子效应，严重降低转化效率，尤其对大质粒（&g …
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