分子生物学

mRNA 在细胞总RNA 中占较小的比例，大量的是核糖体RNA。真核生物的mRNA分离方法利用了大多数mRNA 存在多聚腺苷酸尾巴（有一些mRNA 没有多聚腺苷酸的尾巴）。Poly(A) RNA 可以结合在有多聚寡核苷酸(dT) 的树脂上，在高盐的条件下寡聚胸苷酸－纤维素可以结合PolgA-mRNA, 在低盐的情况下洗脱。这种方法可以批量或者在一个小柱子上操 …

向哺乳动物细胞内转染反义寡核苷酸从而抑制miRNA 功能的具体方法参照本方案。通过检测miRNA 靶蛋白水平或携带miRNA 靶基因的3’端非翻译区( 3UTR ) 报道基因的活性来检测ASO 对于miRNA 的效应。本方案主要针对24 孔板设计，如果用其他多孔板、细胞瓶或不同直径培养皿培养细胞，需根据孔／瓶表面积计算细胞密度和试剂体积 试剂 A …

经常有人做Western-Blot会疑惑：为什么做蛋白实验，应该把杂蛋白去除才对，会担心其他蛋白的加入会影响实验结果，增加背景。但为什么偏偏会用加入BSA，脱脂蛋白的方法减少背景呢？ 这需要从Western-Blot的原理说起，Western-Blot中电泳转膜后让蛋白分布NC膜或PVDF膜上，但膜上还有很多地方是空白的，这些空白的地方如果不被封闭，很可能就 …

PCR 是通过热稳定酶，在模板、dNTPs 和一组与片段3′ 序列互补的引物存在下，对插入物进行次序扩增(Saiki et al. 1988) 。PCR 技术提供的另一优势是在对插入片段的扩增中掺入修正的核苷酸，因此可以生产出不含载体的标记的探针，这排除了在其他方法如缺口翻译所导致的对载体序列的非特异性标记。 目前已有掺入生物素化核苷酸的方法(L …

SDS-PAGE原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 不同蛋白质具有不同的等电点，在进 …

1. 无Ct值出现 检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。 引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。 Ct值出现过晚（Ct>38） 扩增效率低: 反应条 …

慢病毒感染后未能实现敲降的原因可能有多种。以下是一些可能的原因及其解释： 慢病毒包装质量问题： 病毒滴度较低，导致感染效率不高，可能无法有效转导目标细胞。 病毒颗粒中没有足够的有效载体，影响敲降效果。 靶向序列设计问题： shRNA或sgRNA设计不合理，没有有效靶向目标基因的序列。 目标序列与基因组其他部位的相似性导致脱靶效应，影响敲降效果。 感染条件不佳 …

RNA干扰（RNAi），即用20多个核苷 酸组成的短的双链RNA（siRNA）代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，已经迅速而广泛地应用到基因功能，基因表达调控机制研究等热门领域，并为基因 治疗开辟了新的途径。近两年来，这方面的科学论文及报道爆炸性增长，几乎每天都有新的结果涌现。这些论文中，出现了很多与RNA干扰相关的概念，意思很相 近但并不完全相同，这里列举 …

在Western Blot实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确；或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差。所以一般的Western Blot实验都需要进行内参设置。 内参即是内部参照(Internal Control)，Western Blot实验中选择内参作为参照体系对于实验结果的分析具有很好的说明性。对于哺乳动物细胞表达来说，内参一般是指由管家 …

分子信标(molecular beacon)是一种具有发夹结构的新型荧光标记核酸探针，具有高灵敏度、高特异型，其在聚合酶链反应（PCR）、核酸序列的分析、活细胞内核酸的动态检测、蛋白质(酶)与核酸的相互作用等方面具有广泛的应用。 分子信标的结构 分子信标的结构一般包括三个部分：环状区、信标茎干区、荧光基团和猝灭基团。荧光基团一般联接在信标分子的5 端；猝灭基 …