蛋白和酶

Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。可按照以下步骤操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation) 使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。 2. 电泳(Electrophoresis …

1． Bradford 工作液 95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰G250，溶解完后再加磷 85%磷酸 52ml 酸，最后超纯水定容至500ml。过滤后置于棕色瓶 考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保存（Bradford不稳定，一周内有效） 2． 裂解液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4% DTT 60 mM Tris—base 4 …

在Western Blot实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确；或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差。所以一般的Western Blot实验都需要进行内参设置。 内参即是内部参照(Internal Control)，Western Blot实验中选择内参作为参照体系对于实验结果的分析具有很好的说明性。对于哺乳动物细胞表达来说，内参一般是指由管家 …

1、Western Blot原理 Westernblot的原理是蛋白质在电力场的作用下，由大到小的进行排列，利用电泳进行分离和富集。拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体（一抗）特异性识别并与之结合。在此基础上，酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗，通过与底物反应显色来观察目的蛋白。 Westernblot显色的方法主要有以下几种：（1）放射自显影，（2）底物化学发光E …

转子主要有4 种类型：角式、外摆式、连续流式以及区带式。只有角式与外摆式转子是标准的实验室仪器，另外两种只用作专门用途。 角式转子 用途：样品浓缩。实验室中的“苦力” 。 说明：样品沿着与旋转平面成一定角度的方向离心。 优点：离心见效最快。物质具有更高的相对离心力，比在外摆式转子中沉降快。机器的活动组件少，损坏机会小。 缺点：物质被驱向离心管的管壁方向，然后 …

降解是蛋白质纯化过程中最害怕发生的事情。 基本规则： 划重点：做关于蛋白质的实验时，手边一定要备一个冰桶，管子从冰箱或者冷冻的状况下取出时马上放到冰上。 1. 必须冷冻离心，因为离心会产热。 2. 了解蛋白质的特性。每一个蛋白质性质差异很大，热会使你的蛋白质变性吗？有二硫键吗？能反复冻融吗？如果你不知道，那假定它不能被冷冻和再解冻是热变性的。 3. 在细胞裂 …

材料 SP2/0-Ag14 骨髓瘤细胞系（药物标记的非分泌型； ATCC) 添加10mmol/L HEPES 和1mmol/L 丙酮酸钠的DMEM- 10 和DMEM-20 完全焙养基 免疫的实验动物：小鼠、大鼠或仓鼠（在初次接种后10~14d 备用) 50% （m/V) PEG 溶液，无菌 DMEM 完全培养基，未添加血清 氯化铵溶液： 0. 02mol/ …

一、什么是抗体 抗体是一些淋巴细胞直接抵抗外来分子所产生的蛋白质，它们是免疫系统的重要组成成分，是实验室的重要工具。 多克隆抗体是用抗原注射动物产生的，针对相同蛋白质的不同抗原决定簇直接产生的各种不同亲和性的多种免疫球蛋白的混合物。 单克隆抗体是在体外制备的，是免疫淋巴瘤细胞与分泌抗体的浆细胞融合后产生的，整个培养只产生一种抗体（常是IgG) ，直接抵抗外来 …

聚丙烯酰胺凝胶必须由丙烯酰胺单体、聚合起始物、催化剂以及合适的盐及缓冲液的混合物聚合起来。 丙烯酰胺与BIS (N, N’ – 亚甲双丙烯酰胺）是形成胶基质的单体。 过硫酸铵启动胶的聚合过程。胶的配方要求10% 以水配制的过硫酸铵溶液。大多数资料显示需要现配现用。但是，10 ％溶液可以在4℃放置数周而没有明显的活性丢失。最多配制10 …

ChIP的一般流程： 甲醛处理细胞—收集细胞，超声破碎—加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合—加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀—对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合—洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物—解交联，纯化富集的DNA-片断 …