2024年 6月 16日, 星期日
新闻

蛋白和酶

western-blot实验注意事项

• 滤纸、胶、膜之间的大小,一般是滤纸>=膜>=胶。 • 滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡,气泡会造成短路。 • 因为DEPF膜的疏水性,膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中,膜也必须随时保持湿润(干膜法除外)。 • 滤纸可以重复利用,上层滤纸(靠膜)内吸附有很多转移透过的蛋白质,所以上下滤纸一定不能弄混,在不能分辨的情况下,可以将靠胶滤 …

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分子克隆中常用的其他酶

一、DNA 聚合酶 分子克隆中的许多步骤都涉及在DNA 聚合酶催化下的DNA 体外合成反应。这些酶作用时大多需要模板,合成产物的序列则与模板互补。大多数聚合酶优先作用于DNA 模板,但也可拷贝RNA ,尽管这时效率较低。最常用的依赖于DNA 的DNA 聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶 I (全酶)、大肠杆菌DNA 聚合酶I 大片段(Klenow 片段)、T4 …

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western-blot化学发光(ECL)为什么会淬灭?

做Western Blot发光实验经常有“淬灭”的情况发生,经常有朋友反映,加发光试剂后立刻可以看到很明显的亮光,可亮光很快就消逝了,压完片后,条带却很弱,甚至什么也没有。这种情况发生的原因是什么?         要解释这种情况发生的原因,必须先了解ECL化学发光的原理。一般的发光试剂含鲁米诺和H2O2、发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRP和H2O …

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蛋白质的长期保存——以冻结溶液的形式保存

可溶性蛋白质制备物的冷冻是最常用的保存方法之一。将一支装有蛋白质溶液的试管放入机械冰柜中既简单又方便,在低温中,化学降解的速度通常降低,而且如果冷冻本身不引起蛋白质变性,样品应当稳定几周至几个月,特别是将蛋白质样品保存在-80°C 或更低的温度中。然而,冷冻能够引起蛋白质变性,这是因为一些应激而造成的,这些应激包括:低温、溶质的浓度、冰-液体界面的形成和潜在 …

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去除去污剂的可行性

去除去污剂的可行性(根据Harlow 和Lane 1988) 离子型去污剂 用分子筛G25 柱子进行凝胶过滤,对于一些蛋白质来说,用低于临界微团浓度的另一种去污剂来平衡柱子。 加入8 mol/L 的尿素, 然后把去污剂加到离子交换柱上,让蛋白质在8 mol/L 的尿素中流动,再透析去除尿素。 对于离子型的去污剂,有一个相对较低的微粒大小和较高的临界微团浓度, …

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细胞融合与杂交瘤分选

材料 SP2/0-Ag14 骨髓瘤细胞系(药物标记的非分泌型; ATCC) 添加10mmol/L HEPES 和1mmol/L 丙酮酸钠的DMEM- 10 和DMEM-20 完全焙养基 免疫的实验动物:小鼠、大鼠或仓鼠(在初次接种后10~14d 备用) 50% (m/V) PEG 溶液,无菌 DMEM 完全培养基,未添加血清 氯化铵溶液: 0. 02mol/ …

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造成western-blot发光时发生荧光淬灭的因素有哪些?

荧光淬灭是Western Blot发光时常见的现象,即加ECL发光液后立刻可以看到很明显的亮光,但亮光很快就消逝了,压完片后条带却很弱,甚至没有条带,发生这种情况的原因可能有以下几个方面: 1. 抗体浓度太高,局部过多的HRP会快速消耗底物,导致荧光信号过强,条带呈灼烧样。可降低抗体上样量。 2. 抗体浓度太低,荧光信号太弱,可能第一次压片能够获得很弱的条带 …

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western-blot实验中ECL发光检测操作步骤

ECL Western特异发光检测试剂盒用于辣根过氧化物酶(HRP)标记的蛋白或核酸检测。下面以engreen的超敏型ECL发光液Enlight-Plus为例,说一下检测实验步骤。 1. 常规电泳、转膜、HRP 标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。以下操作在室温进行。 注意:Enlight-Plus 推荐的抗体稀释度为: 储存液浓度为1mg/ml 的一抗推荐稀释度 …

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单克隆抗体的制备——杂交瘤的建系

在单克隆抗体的特异性得到充分验证之前,应该对所有候选的杂交瘤进行建系。但为了减少不必要的工作量,可以选择其中20 个最佳的候选孔。在检测这20 个孔的培养上清为阳性后,应该将这些孔的细胞进行冻存,同时进行有限稀释。 附加材料 生长的杂交瘤 克隆和扩增用培养基 24 孔板 4ml 有盖试管,无菌 步骤 当96 孔板中生长的杂交瘤长到2 5%~50 %汇合时(主 …

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Western Blot化学发光(ECL)背景太高的原因?

做Western Blot发光实验经常有“背景太高”问题的出现,要弄清“背景太高”的原因,先要知道“背景”是什么,“背景”也是发光,影响发光的因素就会影响背景。 影响发光的因素主要有:1.含HRP的抗体;2.发光试剂;3.和发光试剂反应的杂质,如含杂质的膜。这里面,在很短时间内曝光造成的背景多是由于含HRP的抗体的因素造成的,抗体浓度过高,洗涤不充分,封闭不 …

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