蛋白和酶

  如果在乙醇沉淀后，核酸中还残留乙醇，就很难用水或缓冲液溶解沉淀。如果你急用或者需要去除大体积的挥发性液体，可以使用真空浓缩设备。真空浓缩设备由离心机、真空泵、加热器和冷凝装置组成，其组合模式多种多样，相关的实验室使用规则变化更多。 一、步骤 使用真空浓缩设备前至少30min 打开冷凝装置。在有些装置中，可能需要加入干冰。 打开真空泵。 开通风管以释放离心 …

慢病毒感染效率低，尽管用胶体金测试显示滴度很高，可能有以下几个原因： 病毒颗粒质量：虽然胶体金检测显示病毒滴度很高，但这并不意味着所有的病毒颗粒都是功能性的。有可能病毒颗粒已经失活或者结构受损，无法有效感染目标细胞。 病毒浓度与效价的差异：胶体金检测主要测量病毒颗粒的数量，但这些颗粒不一定都具有感染性。有效感染的病毒颗粒（感染性单位）可能比实际检测的数量要低 …

一、DNA 聚合酶 分子克隆中的许多步骤都涉及在DNA 聚合酶催化下的DNA 体外合成反应。这些酶作用时大多需要模板，合成产物的序列则与模板互补。大多数聚合酶优先作用于DNA 模板，但也可拷贝RNA ，尽管这时效率较低。最常用的依赖于DNA 的DNA 聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶 I （全酶）、大肠杆菌DNA 聚合酶I 大片段(Klenow 片段）、T4 …

• 滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。 • 滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。 • 因为DEPF膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。 • 滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。 …

荧光淬灭是Western Blot发光时常见的现象，即加ECL发光液后立刻可以看到很明显的亮光，但亮光很快就消逝了，压完片后条带却很弱，甚至没有条带，发生这种情况的原因可能有以下几个方面: 1. 抗体浓度太高，局部过多的HRP会快速消耗底物，导致荧光信号过强，条带呈灼烧样。可降低抗体上样量。 2. 抗体浓度太低，荧光信号太弱，可能第一次压片能够获得很弱的条带 …

Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。可按照以下步骤操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation) 使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。 2. 电泳(Electrophoresis …

做Western Blot发光实验经常有“背景太高”问题的出现，要弄清楚“背景太高”的原因，先要知道“背景”是什么，“背景”也是发光，影响发光的因素就会影响背景。     影响发光的因素主要有：1.含HRP的抗体；2.发光试剂；3.和发光试剂反应的杂质，如含杂质的膜。这里面，在很短时间内曝光造成的背景多是由于含HRP的抗体的因素造成的，抗体浓度过高，洗涤不充 …

下列步骤描述了使用Cy3作为代表性标记试剂， 用荧光succinimidy l 活性酶标记羊抗体。其他水溶性荧光标记物的使用与此类似(Mujumdar et al. 1993) 抗体分离与纯化 来源于血清，腹水或培养基的抗体，在标记反应开始以前，需纯化以除去蛋白质和其他含有氨基团的分子。在与标记反应混合以前，抗体不应进行强缓冲处理，不然标记混合物会降低，所有 …

常见问题                                         …

去除去污剂的可行性（根据Harlow 和Lane 1988) 离子型去污剂 用分子筛G25 柱子进行凝胶过滤，对于一些蛋白质来说，用低于临界微团浓度的另一种去污剂来平衡柱子。 加入8 mol/L 的尿素， 然后把去污剂加到离子交换柱上，让蛋白质在8 mol/L 的尿素中流动，再透析去除尿素。 对于离子型的去污剂，有一个相对较低的微粒大小和较高的临界微团浓度， …