2024年 2月 24日, 星期六
新闻

蛋白和酶

测定蛋白质浓度前需要知道什么?

因为蛋白质是细胞结构与功能的主要分了成分,因此常常需要测定样品中蛋白质的含量,鉴定混合物中的特殊蛋白质,以及分析蛋白质的组成和序列。此外,蛋白质分析对合成用于诱导抗体生成的多肽,设计供克隆用的寡核苷酸探针以及证实序列数据的正确性是十分必要的。 为确保蛋白质通过电泳技术获得最好的分离,首先有必要估计待测样品中蛋白质的浓度。如果不做分析,蛋白质总量不足就可能妨碍 …

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造成western-blot发光时发生荧光淬灭的因素有哪些?

荧光淬灭是Western Blot发光时常见的现象,即加ECL发光液后立刻可以看到很明显的亮光,但亮光很快就消逝了,压完片后条带却很弱,甚至没有条带,发生这种情况的原因可能有以下几个方面: 1. 抗体浓度太高,局部过多的HRP会快速消耗底物,导致荧光信号过强,条带呈灼烧样。可降低抗体上样量。 2. 抗体浓度太低,荧光信号太弱,可能第一次压片能够获得很弱的条带 …

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western-blot实验常见问题及解答

常见问题 解决对策   两块玻璃板之间灌胶,胶总是不平 玻璃没有洗干净,应该洗得很干净 过硫酸铵和TEMED加量相对较多 加完试剂后应摇匀            总是漏胶 避免玻璃边缘(与胶条接触处)破损 将两块玻璃板摆放对齐,底部处于同一平面 膜上有明显气泡 操作时将气泡完全排除 靠膜一侧的滤纸应铺平   特异性低 优化一抗 提高一抗和 …

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蛋白质分离实验——细胞裂解方法

当分离蛋白质时,包含有蛋白质的细胞和细菌须先被裂解。物理法裂解。利用各种机器来完成,例如:1. 氮气气穴弹。氮气解压是裂解真核细胞的一种温和方法,存在于一定压力下的氮气与细胞内的氮气达到平衡。释放压力时,溶液中产生的氮气和间歇的气泡导致单个细胞膜的破裂,但不再有进一步的细胞裂解发生,细胞器还是保持完整,而且氮气产生的压力和气温降低都会保护蛋白质不被降解。2. …

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双向电泳相关试剂配制

1. Bradford 工作液 95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰G250,溶解完后再加磷 85%磷酸 52ml 酸,最后超纯水定容至500ml。过滤后置于棕色瓶 考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保存(Bradford不稳定,一周内有效) 2. 裂解液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4% DTT 60 mM Tris—base 4 …

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WB内参的重要性

在Western Blot实验中,可能存在总蛋白浓度测定不准确;或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差。所以一般的Western Blot实验都需要进行内参设置。 内参即是内部参照(Internal Control),Western Blot实验中选择内参作为参照体系对于实验结果的分析具有很好的说明性。对于哺乳动物细胞表达来说,内参一般是指由管家 …

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去除去污剂的可行性

去除去污剂的可行性(根据Harlow 和Lane 1988) 离子型去污剂 用分子筛G25 柱子进行凝胶过滤,对于一些蛋白质来说,用低于临界微团浓度的另一种去污剂来平衡柱子。 加入8 mol/L 的尿素, 然后把去污剂加到离子交换柱上,让蛋白质在8 mol/L 的尿素中流动,再透析去除尿素。 对于离子型的去污剂,有一个相对较低的微粒大小和较高的临界微团浓度, …

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Western blot实验最常见的10个问题及解决方案

1、Western Blot原理 Westernblot的原理是蛋白质在电力场的作用下,由大到小的进行排列,利用电泳进行分离和富集。拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体(一抗)特异性识别并与之结合。在此基础上,酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗,通过与底物反应显色来观察目的蛋白。 Westernblot显色的方法主要有以下几种:(1)放射自显影,(2)底物化学发光E …

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western-blot化学发光(ECL)出现高背景的原因是什么?

做Western Blot发光实验经常有“背景太高”问题的出现,要弄清楚“背景太高”的原因,先要知道“背景”是什么,“背景”也是发光,影响发光的因素就会影响背景。     影响发光的因素主要有:1.含HRP的抗体;2.发光试剂;3.和发光试剂反应的杂质,如含杂质的膜。这里面,在很短时间内曝光造成的背景多是由于含HRP的抗体的因素造成的,抗体浓度过高,洗涤不充 …

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western-blot化学发光时,出现非特异条带,该怎么办?

出现杂带或非特异条带的原因可能有以下几个方面: 1. 蛋白上样量过大。可降低蛋白上样量。 2. 一抗是多克隆抗体,或一抗、二抗浓度太高。可更换成单克隆抗体,或降低抗体浓度,缩短抗体孵育时间,优化一抗和二抗的使用浓度。 3. 洗膜不充分。可增加洗膜次数和Buffer用量,延长洗膜时间,或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20。 4. …

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