2022年 5月 17日, 星期二
新闻

蛋白和酶

western-blot实验时,胶片上条带很弱怎么办?

条带弱的原因可能有以下几个方面: ①. 因为蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成。可适当加大蛋白上样量,也可通过提高抗体稀释度或采用灵敏度更高的发光底物来调整,如英格恩的Enlight-plus。 ②. 蛋白没有充分转移到膜上。转膜后可通过预染Marker判断转膜效率,也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶,判断转膜效率。 ③. 抗体效价 …

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如何进行完美的Western Blot实验

条带清晰就是完美的吗?用图像软件调节明暗,用曝光时间来筛选,这样的结果可靠吗?如果在眼花缭乱的品牌和产品中快速准确地挑选好的实验用品?本视频用简短实用的方法告诉你。 本视频下载链接:https://www.engreen.cn/wp-content/uploads/2020/12/Western-Blot实验.mp4

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western-blot化学发光(ECL)为什么会淬灭?

做Western Blot发光实验经常有“淬灭”的情况发生,经常有朋友反映,加发光试剂后立刻可以看到很明显的亮光,可亮光很快就消逝了,压完片后,条带却很弱,甚至什么也没有。这种情况发生的原因是什么?         要解释这种情况发生的原因,必须先了解ECL化学发光的原理。一般的发光试剂含鲁米诺和H2O2、发光增强剂等物质。发光试剂中的鲁米诺被HRP和H2O …

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分子克隆中常用的其他酶

一、DNA 聚合酶 分子克隆中的许多步骤都涉及在DNA 聚合酶催化下的DNA 体外合成反应。这些酶作用时大多需要模板,合成产物的序列则与模板互补。大多数聚合酶优先作用于DNA 模板,但也可拷贝RNA ,尽管这时效率较低。最常用的依赖于DNA 的DNA 聚合酶是大肠杆菌DNA 聚合酶 I (全酶)、大肠杆菌DNA 聚合酶I 大片段(Klenow 片段)、T4 …

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蛋白质的保存方法如何选择?

保存方法的选择取决于几个因素,包括蛋白质内在的稳定性、所需的保存时间的长短和对于防止破坏所要求的程度。这些因素有很大的变异性,但是,在大多数情况下都应当遵守以下常规的准则。 如果仅仅是要将小批量的纯化蛋白质保存约几天的时间,那么通常只要以非冷冻的溶液形式4°C保存即可,如果需要保存较长的时间,或如果有明显的蛋白质降解(如可见的沉淀物或不可接受的功能损失),那 …

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导致western Blot发光(ECL)“背景高”的原因有哪些?

Western Blot发光经常有“背景太高”问题,导致“背景高”的原因有很多,主要有以下几个方面: 1. 抗体浓度过高,洗涤不充分,可以造成抗体在膜上的非特异结合,导致高背景。可通过降低抗体稀释度,增加洗膜次数和Buffer用量,或在Wash Buffer中添加终浓度0.05%的Tween-20加以改善。 2. 封闭不充分,会造成抗体在膜上的非特异结合,导 …

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双向电泳相关试剂配制

1. Bradford 工作液 95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰G250,溶解完后再加磷 85%磷酸 52ml 酸,最后超纯水定容至500ml。过滤后置于棕色瓶 考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保存(Bradford不稳定,一周内有效) 2. 裂解液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4% DTT 60 mM Tris—base 4 …

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Western Blot化学发光(ECL)背景太高的原因?

做Western Blot发光实验经常有“背景太高”问题的出现,要弄清“背景太高”的原因,先要知道“背景”是什么,“背景”也是发光,影响发光的因素就会影响背景。 影响发光的因素主要有:1.含HRP的抗体;2.发光试剂;3.和发光试剂反应的杂质,如含杂质的膜。这里面,在很短时间内曝光造成的背景多是由于含HRP的抗体的因素造成的,抗体浓度过高,洗涤不充分,封闭不 …

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SDS-PAGE蛋白质样品的制备

将收集的各样品加入等体积的2×SDS-PAGE Loading Buffer,煮沸裂解5min,冰浴2min,12,000rpm离心10min,取上清-20℃保存备用。 SDS-PAGE蛋白质电泳 1)按照电泳装置的使用说明,装好洁净干燥的玻璃板。 2)分离胶的制备 按下列成分配制10mL 12%分离胶: ddH2O 30%丙烯酰胺混合液 1.5M Tris …

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