2022年 8月 20日, 星期六
新闻

免疫球蛋白G (IgG) 的纯化(一)

基本方案1 硫酸铵沉淀和凝胶过滤层析

硫酸铵沉淀可纯化小鼠抗体的所有亚类和其他种属抗体,本方案也可用于纯化任何种属的lgM 、lgG 和lgA

材料

  • 腹水或MAb 上清
  • PBS
  • 饱和硫酸铵(SAS)
  • 硼酸盐缓冲液(可选)
  • 聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶S-200 Superfine (Pharmacia Biotech)
  • 含有0. 02% (m/V) NaN3 的PBS (可选)
  • 玻璃棉(Glasswool, Polysciences)
  • Sorvall 离心机, SS-34 型转子(或类似转子)
  • 透析袋(无需按分子质量精确截断),保存于蒸馏水中
  • 26mmX900mm 层析柱

流程

1a. 适用于腹水:为了清除腹水中的脂类物质, 可用足量玻璃棉盖住漏斗口,然后倒入腹水,再用PBS 充分冲洗玻璃棉,并戴好手套,轻轻挤压玻璃棉,收集全部样品(处理玻璃棉的时候请戴手套),将滤出液于4°C 或室溫下, 20000g 离心30min ,轻轻倒出上清并保存,弃去含膜和细胞碎片的沉淀。

1b. 适用于MAb 上清:将MAb 上清于4℃ 或室温下, 20000g 离心30min, 轻轻倒出上清并保存。

2. 边搅拌边慢慢向腹水或MAb 上清中加入SAS 至终浓度45% (V/V) ,静置1~2h 或4°C 静置过夜,保证使所有蛋白质沉淀。

3. 4°C 或室温下, 20000g 离心1h, 保留上清以检测抗体活性。用最小体积的PBS 或硼酸盐缓冲 (10~20ml) 溶解沉淀并转移到透析袋中。于4°C 在至少20 倍体积的PBS 或硼酸缓冲液中透析24~48h, 在透析过程中更换透析液4~6 次,最后将蛋白质浓缩至≤5ml。

4. 准备26mmX900mm 聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶S-200 Superfine 层析柱,将浓缩的蛋白质溶液上样 。用PBS, 或含0. 02% NaN3 的PBS 或硼酸缓冲液洗脱蛋白质,收集100 个组分(每个组分为1 %柱体积,约4. 5ml) 。在280nm 波长检测蛋白质组分。

5. 用非还原型和还原型10 %聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 A280>0.5 组分的蛋白质纯度。在非还原型凝胶上lgG 的条带在150kDa 左右,在还原型凝胶上,55kDa 左右的条带为lgG 重链, 25 kDa 左右的条带为lgG 的轻链。IgG2b 的重链呈非对称的糖基化,通常以二聚体形式存在。

6. 用分光光度计测定lgG A280 浓度 。将含纯 lgG 的洗脱液合并,用硼酸缓冲液或含0.02% NaN3 的PBS 调整IgG 浓度至0.1~30mg/ml, 可在4°C 保存数年。长期保存可以将lgG 置于- 70°C 保存,不要将抗体在- 20°C 储存超过一个月,要避免抗体的反复冻融。

 

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