2022年 8月 20日, 星期六
新闻

免疫球蛋白G ( IgG) 片段的水解(二)

基本方案2   木瓜蛋白酶水解IgG 获取Fab 片段的大量制备

材料

  • 木瓜蛋白酶 ( 2 X 重结晶悬液 )
  • 水解缓冲液:0.02mol/L EDTA ( 二钠盐) / 0.02mol/L 半胱氨酸/PBS (新鲜配制,冰上保存<10h)
  • 溶于PBS 中浓度≥1mg/ml 的IgG ( 总量≥5mg )
  • 碘乙酰胺结晶
  • PBS, pH8. 0
  • 蛋白A 交联琼脂糖凝胶CL-4B
  • 聚丙烯酰胺葡聚糖 S-200 Superfine
  • 硼酸盐缓冲液, 可选
  • 10% (m/V) NaN3 , 可选
  • 5mmX100mm 层析柱
  • 26mm X 900mm 层析柱

流程

  1. 混匀木瓜蛋白酶悬液,避免振荡。加入与待水解抗体相等体积的水解缓冲液溶解木瓜蛋白酶,选择从摸索性试验中已确定的最佳酶量、抗体浓度和孵育时间进行实验。
  2. 将木瓜蛋白酶液加入浓度为≥1mg/ml 溶于PBS 的IgG 中,混匀, 37°C 水浴至所需时间 。加入结晶碘乙酰胺至终浓度0. 03mol/L 中止水解反应,小心混匀,确保碘乙酰胺完全溶解。
  3. 将反应液转至透析袋中 ,在4°C 下对2L PBS pH8. 0 透析12~20h 。
  4. 准备5mmX100mm 蛋白A 交联琼脂糖凝胶CL-4B 层析柱将透析液上样。收集含有Fab 片段和酶的未结合流穿液。如有需要,用PBS 充分洗柱,收集所有Fab 片段。
  5. 将含有Fab 片段的流穿液浓缩至≤5ml 。
  6. 将浓缩液上样至26mm X900mm 聚丙烯酰胺葡聚糖S-200 Superfine 层析柱,收集分子质量大小为50kDa 的组分,用SDS-PAGE 法鉴定分子质量大小或使用预平衡的凝胶过滤层析柱。
  7. 将1~80μl 终产物用10 %非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳鉴定终产物的纯度。通过测定A280值,确定Fab 片段浓度 。将Fab 片段保存在硼酸缓冲液中,于4℃保存;或者保存在含0. 02% NaN3 的PBS 中,于- 70°C保存。

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